微塑料暴露促进前列腺癌迁移与侵袭的作用机制研究——基于网络毒理学与单细胞测序技术

《Frontiers in Oncology》：Study on the promoting effect of microplastic exposure on prostate cancer migration and invasion based on network toxicology and single-cell sequencing technology

　　

背景： 前列腺癌（PCa）是威胁全球男性健康的主要恶性肿瘤。广泛用作邻苯二甲酸酯替代品的增塑剂乙酰柠檬酸三丁酯（ATBC）在人体组织中的检出率日益增高，然而其在PCa细胞迁移与侵袭中的作用及潜在机制仍知之甚少。 方法： 本研究整合了网络毒理学、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、转录组学分析、孟德尔随机化（MR）及机器学习。在体外实验中，评估了ATBC处理后LNCaP细胞的增殖、迁移与侵袭能力。利用公共数据库预测了ATBC的毒性靶点。分析了scRNA-seq数据以识别关键细胞簇及候选基因。通过MR评估了候选基因与PCa之间的因果关系，并在多个队列及HPA免疫组化数据中验证了关键基因。采用分子对接与虚拟基因敲除探索结合亲和力及功能影响。 结果： 本研究首先进行了体外实验，发现经ATBC处理的LNCaP细胞的增殖、迁移与侵袭能力发生显著改变。随后，通过分析scRNA-seq数据识别出关键细胞（上皮细胞）。接着，利用公共数据库预测ATBC的毒性靶点，并整合scRNA-seq与转录组学分析结果，筛选出ATBC在PCa中的潜在靶基因。最终，通过MR与机器学习技术获得了关键基因（LPCAT1与PDK1）。此外，ATBC的分子对接结果证实了关键基因与ATBC之间存在良好的结合亲和力。虚拟敲除结果亦表明关键基因在肿瘤迁移与侵袭中发挥作用。 结论： ATBC暴露可能通过靶向LPCAT1与PDK1，扰乱细胞骨架动力学及代谢通路，从而促进PCa的迁移与侵袭。这些发现为微塑料相关的PCa进展提供了新的机制见解。

论文解读：微塑料暴露促进前列腺癌迁移与侵袭的机制研究

一、研究背景与意义

前列腺癌（PCa）是全球男性高发的恶性肿瘤，其发病率和死亡率持续上升。尽管已知高龄、家族史、遗传易感基因及激素失衡等风险因素，但仍无法完全解释疾病的全貌，提示存在其他致病因素。近年来，环境污染物尤其是塑料及其添加剂在人体组织中被频繁检出，其对PCa发生发展的影响受到高度关注。乙酰柠檬酸三丁酯（ATBC）作为邻苯二甲酸酯（PAE）类增塑剂的环保替代品，因其低挥发性和优良表面性能被广泛应用。然而，ATBC通过物理混合方式存在于塑料制品中，极易从食品包装和医疗器械中迁移至环境并进入人体。已有研究显示微塑料可影响多种癌症的细胞迁移与侵袭，且在人类前列腺组织中检测到微塑料聚合物，但其与PCa迁移和侵袭的内在关联尚不明确。因此，本研究旨在通过网络毒理学、单细胞测序等技术，系统揭示ATBC暴露对PCa恶性行为的影响及其分子机制。

二、主要技术方法

研究人员综合运用了以下关键技术方法：

1. 1.
   体外细胞实验：采用CCK-8法、细胞划痕实验、Transwell迁移与侵袭实验，评估不同浓度ATBC对人前列腺癌LNCaP细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。
2. 2.
   网络毒理学与多组学整合分析：利用ChEMBL、SwissTargetPrediction、STITCH等公共数据库预测ATBC毒性靶点；从GEO数据库获取三个PCa转录组数据集（训练集GSE46602，验证集GSE38241和GSE316750）及六个单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（共92例样本，46例PCa vs. 46例对照），进行差异表达分析和单细胞分析。
3. 3.
   单细胞分析：使用Seurat包进行数据预处理、降维聚类和细胞注释；通过AUCell评分评估ATBC靶点在各类细胞中的活性；利用fastCNV推断拷贝数变异（CNV）；对关键细胞亚群进行二次聚类，并根据TGF-β信号通路评分确定关键细胞簇。
4. 4.
   孟德尔随机化（MR）分析：以候选基因的表达数量性状位点（eQTL）为暴露，PCa全基因组关联研究（GWAS）汇总数据（ebi-a-GCST90018905，含11599例病例和199628例对照）为结局，评估因果效应。
5. 5.
   机器学习：采用LASSO回归、支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）和Boruta算法三种方法进行特征选择，取交集确定关键基因。
6. 6.
   分子对接与虚拟基因敲除：通过CB-Dock2平台进行ATBC与关键蛋白的分子对接；利用scTenifoldKnk包模拟关键基因敲除后的表达扰动。

三、研究结果

3.1 ATBC对前列腺癌LNCaP细胞的影响

CCK-8结果显示，100 nM和1000 nM的ATBC显著促进LNCaP细胞增殖。划痕实验和Transwell迁移实验均显示，上述浓度ATBC处理组的伤口愈合率和迁移细胞数显著高于对照组。侵袭实验同样证实，ATBC处理组侵袭细胞数明显增加。这表明ATBC能够增强LNCaP细胞的迁移和侵袭能力。

3.2 单细胞分析与关键细胞鉴定

通过对整合后的scRNA-seq数据进行质量控制，获得271,005个高质量细胞，聚类后鉴定出11种细胞类型。其中，上皮细胞在PCa组中比例增幅最大，且其CNV评分显著高于其他细胞类型。AUCell评分显示ATBC靶点在上皮细胞中活性较高。综合以上证据，上皮细胞被确定为后续分析的关键细胞类型。

3.3 关键上皮细胞亚群的鉴定与分析

对上皮细胞进行二次聚类，得到三个亚群：腔上皮细胞、Club样上皮细胞和双阴性基底样上皮细胞。TGF-β信号通路AUCell评分显示，双阴性基底样上皮细胞得分最高，被定为关键细胞簇。在该亚群的高/低TGF-β评分组间进行差异分析，获得5717个差异表达基因（DEGs-sc），KEGG富集分析显示这些基因显著富集于PI3K-Akt、MAPK和TGF-β等通路。

3.4 候选基因的筛选与富集分析

训练集差异分析获得3045个DEGs。通过整合ATBC毒性靶点（142个）、PCa相关靶点（3232个）、DEGs-sc及DEGs，取交集得到9个候选基因。GO和KEGG富集分析显示这些基因显著富集于细胞迁移与侵袭相关条目，如血管内皮细胞迁移调控、膜筏、Toll样受体结合及醚脂代谢等通路。PPI网络分析显示9个候选基因间存在密切相互作用。

3.5 孟德尔随机化分析

对9个候选基因进行双向MR分析，以IVW方法为主要分析方法，发现LPCAT1、PDK1和NEU1三个基因与PCa存在显著因果关联（均为风险因子，OR>1）。敏感性分析（异质性检验、水平多效性检验、留一法分析）证实结果稳健，MR-Steiger方向性检验确认因果方向正确。结合差异表达方向，最终保留LPCAT1和PDK1（OR>1且logFC>0）。

3.6 关键基因的鉴定与验证

通过LASSO、SVM-RFE和Boruta三种机器学习算法的交叉验证，LPCAT1和PDK1被共同筛选为候选关键基因。在训练集和两个独立外部验证集中，这两个基因在PCa组中的表达均显著高于对照组，趋势一致，被正式确定为关键基因。HPA数据库免疫组化数据显示，LPCAT1蛋白在肿瘤组织中显著上调，而PDK1蛋白染色强度无明显变化。

3.7 关键基因的GSEA富集分析与免疫微环境分析

GSEA分析显示，LPCAT1和PDK1均富集于泛素介导的蛋白水解通路。此外，LPCAT1显著上调肌动蛋白细胞骨架调控和ECM-受体相互作用等与迁移侵袭密切相关的通路；PDK1则富集于钙信号通路，同时显著下调氧化磷酸化和TGF-β信号通路。免疫微环境分析发现，PCa组与对照组间有14种免疫细胞浸润丰度存在显著差异。相关性分析显示，LPCAT1与单核细胞呈最强正相关，与未成熟树突状细胞呈最强负相关；PDK1与肥大细胞呈最强负相关。

3.8 关键基因与ATBC的分子对接

分子对接结果显示，ATBC与LPCAT1蛋白的结合能为-6.1 kcal/mol，与PDK1蛋白的结合能为-6.2 kcal/mol，均低于-5.0 kcal/mol，表明ATBC对两种蛋白具有良好的结合活性。

3.9 关键基因的虚拟敲除分析

分别对LPCAT1和PDK1进行虚拟敲除，共鉴定出5个显著受扰动的基因。GO和KEGG富集分析显示这些扰动基因富集于代谢、迁移和侵袭相关信号通路，进一步支持LPCAT1和PDK1在PCa代谢重编程及肿瘤迁移侵袭中的驱动作用。

3.10 关键基因的拟时序动态表达分析

拟时序轨迹分析显示，细胞由低伪时间状态向外延伸，逐渐过渡至高伪时间状态。双阴性基底样上皮细胞分布于早期阶段，Club样上皮细胞处于中期，腔上皮细胞位于终末分化状态。LPCAT1和PDK1在早期分化阶段维持低基线表达，随伪时间推进至中后期，两者表达同步逐渐升高，在腔上皮细胞中达到峰值，提示两者在上皮细胞分化过程中可能呈现协同表达特征。

3.11 关键细胞的通讯分析

细胞通讯分析显示，PCa组与对照组中细胞间通讯均活跃，T细胞节点最大，可能是中心通讯枢纽。PCa组中肿瘤上皮亚群与成纤维细胞、巨噬细胞和单核细胞的高频互作更为普遍。配体-受体分析显示，PCa组织中存在更复杂的细胞间通讯模式，涉及血管重塑、炎症反应及迁移侵袭。上皮细胞主要通过VEGF、PDGFA和GDF15向内皮细胞和基质细胞发送强信号，而巨噬细胞和肥大细胞等免疫细胞则通过EREG和AREG等分子反向作用于肿瘤上皮细胞，形成促癌旁分泌环路。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究通过体外实验首次证实ATBC可显著增强LNCaP细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结合网络毒理学、单细胞转录组学、孟德尔随机化和多种机器学习算法，揭示了ATBC可能通过调节关键基因干扰代谢重编程、细胞迁移和侵袭，进而驱动PCa恶性进展。其中，LPCAT1作为磷脂酰胆碱代谢关键酶，在PCa组织中显著上调，可能通过重塑磷脂代谢、上调细胞骨架调控通路促进迁移侵袭；PDK1作为丙酮酸脱氢酶复合物的负调控激酶，可促使代谢转向有氧糖酵解，并通过钙信号通路和免疫微环境调节支持肿瘤侵袭。单细胞分析进一步明确了上皮细胞为关键细胞类型，其中双阴性基底样上皮细胞TGF-β活性最高。拟时序分析显示LPCAT1和PDK1在分化中后期表达协同升高。细胞通讯分析揭示了PCa微环境中更复杂的互作网络。研究也指出了局限性，包括依赖公共数据库和细胞水平验证，未来需通过表面等离子共振（SPR）、等温滴定量热法（ITC）或细胞热转变分析（CETSA）验证结合，并开展体内实验和临床样本验证。

研究结论： 本研究结合体外细胞实验与多层次生物信息学分析，揭示了微塑料相关化合物ATBC及其毒性靶点（LPCAT1和PDK1）促进前列腺癌（PCa）迁移与侵袭的潜在机制。其中，LPCAT1可能通过重塑磷脂酰胆碱代谢、增强肌动蛋白细胞骨架及细胞外基质-受体相互作用，从而促进细胞骨架重排和细胞-基质粘附。PDK1可能诱导糖酵解转换、抑制氧化磷酸化并调控钙信号通路，从而改变免疫浸润状态，支持肿瘤侵袭并构建有利微环境。总之，ATBC暴露可能通过异常激活LPCAT1和PDK1促进PCa转移。本研究不仅探讨了LPCAT1和PDK1对PCa恶性行为的潜在影响，还为评估微塑料环境污染物暴露相关的转移风险提供了新的潜在生物标志物及前瞻性干预靶点。