清醒与麻醉小鼠宏观脑能量效率对应神经元网络重构：rPWR/rCST与双光子钙成像的跨尺度研究

《Frontiers in Neuroscience》：Macroscopic cerebral energy efficiency corresponds to neuron reorganization in awake and anesthetized mice

　　

引言：对脑功能和能量供应的非侵入性成像对于诊断和治疗脑疾病至关重要。传统成像难以捕捉脑疾病引起的能量供应与需求关系改变。一种迄今仅在人类受试者中进行非侵入性测试的新方法是计算相对功率（relative power, rPWR）和相对成本（relative cost, rCST）以评估脑能量效率。然而，rPWR/rCST是否追踪个体变化并与神经活动相关仍未得到证实。方法：研究人员检查清醒和麻醉雄性小鼠，并将rPWR/rCST与侵入性双光子显微镜（two-photon microscopy）进行比较。结果：研究人员发现，rPWR/rCST分布在清醒小鼠与人类之间相似，但在麻醉小鼠中发生变化，表明脑经济平衡发生转移。此外，rPWR/rCST的变化与通过双光子显微镜观察到的微观神经网络重组相关。讨论：研究人员的工作强调rPWR/rCST在医学应用中的潜力，并表明神经网络重组与脑经济平衡相关。

研究背景：脑组织高度依赖能量，约占全身氧耗的20%，而重量仅占约2%。能量代谢改变可作为神经退行性疾病诊断与治疗的生物标志物，能量利用与神经元活动之间存在强关联。脑发育在进化与个体层面均需平衡布线成本与神经元连接优化，最短路径连接和小世界网络结构可提高信息传递效率并优化认知功能。神经退行性疾病如阿尔茨海默病会破坏这些网络并损害认知效率。晚期代谢紊乱相对明显，但早期代谢改变较微妙，当前检测灵敏度低，限制临床诊断。功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, fMRI）广泛用于研究脑能量动态，其血氧水平依赖（blood oxygen level-dependent, BOLD）信号可推断神经活动；BOLD信号是脑氧代谢率（cerebral metabolic rate of oxygen, CMRO₂）、脑血流量（cerebral blood flow, CBF）和脑血容量（cerebral blood volume, CBV）的组合。校准fMRI可结合BOLD与CBF或CBV测量CMRO₂，传统方法需气体挑战；基于弛豫测量的校准fMRI利用磁弛豫图，无需气体校准，便于动物实验和临床研究。微观改变显著影响宏观脑代谢。阿尔茨海默病模型中，受累皮层区神经元损伤导致星形胶质细胞损伤，促成血管功能障碍和CBF降低，最终影响CMRO₂。许多研究将脑活动与能量消耗联系起来，但神经退行性疾病破坏这种关系。rPWR和rCST被开发用于比较能量供应与需求，其中rPWR反映总神经代谢活动，rCST量化能量效率，来源于fMRI局部功能连接密度（local functional connectivity density, lFCD）作为能量需求代理，以及来自¹⁸F-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描（¹⁸F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography, FDG-PET）的脑葡萄糖代谢率（cerebral metabolic rate of glucose, CMRglc）或MRI的CBF等代谢标志物。既往该方法对酒精诱导的代谢变化敏感，但仍有关键问题：rPWR和rCST是否在个体不同状态中追踪神经代谢变化尚不清楚；这些测量背后的精确神经活动未知，限制其用于靶向神经元功能的治疗；rPWR和rCST尚未在动物模型中计算，因此能否在动物模型与人类受试者之间转化也未知。为此，研究人员采用清醒与麻醉小鼠模型，整合非侵入性fMRI与侵入性双光子钙成像（two-photon calcium imaging, 2PCI），首次在小鼠模型中应用rPWR/rCST分析，并首次将其与双光子钙成像结合，从而将宏观脑能量效率与微观神经元网络组织联系起来。研究人员假设麻醉会引起能量利用效率和神经元网络组织的显著改变。

研究人员开展了清醒与右美托咪定（dexmedetomidine, Dex）麻醉小鼠的MRI与2PCI研究。MRI数据来自两项先前发表工作，但本研究中的rPWR、rCST和脑区选择等主要数据分析方法与结果为本研究独有；2PCI数据为新采集的独立小鼠队列，作为MRI引导的后续实验。MRI实验使用14只雄性C57BL/6小鼠，7至9周龄，体重20至30克，来源于上海实验中心。小鼠在9.4 T MRI系统扫描，采集脑结构T₂ Turbo RARE、T₂和T₂^*磁弛豫常数图、CBF信号和BOLD信号等。fMRI预处理后，使用lFCD计算局部功能连接密度，PCC阈值为0.25、空间邻域直径2 mm；并去除与时间信噪比显著相关的区域。采用基于弛豫测量的校准fMRI获得相对CMRO₂，其中A=69.3257，α=0.2，β=0.8。rPWR和rCST由标准化log(lFCD)和标准化CMRO₂经45°逆时针旋转计算，其中CMRO₂用作代谢供应，lFCD用作代谢需求。双光子钙成像在rPWR/rCST显著变化的ACA和未显著变化的SS区域进行，另用4只雄性C57BL/6J小鼠，每个脑区2只，来源于作者机构动物核心设施；清醒与Dex状态在同一小鼠中重复成像，注射AV2/9-hsyn-GCaMP6f-WPRE-pA，分析钙事件频率、幅度和持续时间，并计算小世界性。统计分析采用配对t检验，p值经顺序拟合优度元检验（sequential goodness of fit metatest, SGoF）多重比较校正，并进行参数敏感性分析。

关键技术方法概括：研究整合清醒与Dex麻醉小鼠的fMRI与双光子钙成像；MRI数据来自两项先前发表工作，双光子数据为新采集独立小鼠队列。MRI采用9.4 T系统采集BOLD、pCASL、T₂/T₂^*等；以lFCD为需求、CMRO₂为供应，经旋转计算rPWR/rCST；2PCI在ACA和SS区域进行，注射GCaMP6f并分析钙瞬变与小世界性；统计采用配对t检验、SGoF校正和敏感性分析。样本来源包括上海实验中心14只雄性C57BL/6小鼠和作者机构动物核心设施4只雄性C57BL/6J小鼠。

研究结果：
3.1 Relative power (rPWR) and relative cost (rCST) derived from functional connectivity density (lFCD) and cerebral metabolic rate of oxygen (CMRO₂)：研究人员以CMRO₂作为代谢供应、lFCD作为代谢需求计算rPWR和rCST。此前工作也使用lFCD作为需求，但供应采用CMRglc或CBF；健康受试者CMRO₂与CMRglc和CBF高度相关，并可能反映BOLD的代谢供应，因此适合作为局部能量供应测量。使用CBF或CMRO₂也可仅用MRI测量rPWR和rCST。研究人员基于既往小鼠模型工作比较清醒与麻醉状态，麻醉可显著调节三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环，进而改变CMRO₂和CBF。
3.2 rPWR and rCST changes between the awake and Dex groups within the same mice：研究人员记录fMRI以lFCD测量能量需求，并用校准fMRI以CMRO₂测量能量供应，计算清醒和Dex状态下的rPWR和rCST。结果显示，rPWR和rCST在同一小鼠的清醒与Dex状态间存在显著、区域特异性的变化。以ACA为例，rPWR显著增加而rCST显著降低；lFCD在多数脑区呈下降趋势，但显著差异仅见于PERI、ECT和HY；CMRO₂在多数区域显著下降。相较lFCD和CMRO₂，rPWR和rCST的变化异质性更强，并突出特定区域。
3.3 Comparison of rPWR and rCST between humans and awake mice：该研究首次在小鼠模型中应用rPWR和rCST。健康人类数据在默认模式网络（default mode network, DMN）显示较高rPWR，DMN是最活跃且能量需求最高的网络。与人类数据相似，清醒小鼠在ACA区域显示较高rPWR，而ACA在啮齿类中被认为与人类DMN同源；20个脑区中最高rPWR位于额极（frontal pole, FRP），可能与FRP区域TCA循环相关蛋白高分布有关。人类和小鼠ACA均显示较低rCST。
3.4 Enhanced differentiation of ACA and SS regions through rPWR and rCST metrics：与lFCD和CMRO₂相比，rPWR和rCST在区域变化上表现出更明显的分化。使用lFCD或CMRO₂时，ACA和SS区域呈现相似模式，未显著偏离整体数据集；应用rPWR和rCST后，ACA与SS区域出现鲜明对比，ACA成为具有统计学显著差异的离群区域，显示其对麻醉的独特反应。这表明rPWR和rCST提供了此前未用于评估脑活动状态变化的独特信息。
3.5 Anesthesia induced a decrease of neuronal activity within the SS and ACA regions：基于rPWR和rCST结果，研究人员选择SS作为对麻醉无或最小反应的区域，ACA作为对麻醉有强且显著反应的区域，并在清醒与Dex条件下进行2PCI。结果发现，SS区域中Dex下钙瞬变频率和幅度显著降低，持续时间无显著变化；ACA区域中幅度和持续时间在清醒与Dex间无显著差异，但趋势与SS相似，频率在Dex下显著降低。
3.6 Small-worldness increased under Dex within the ACA region only：图论方法将每个神经元视为节点，以连接程度分配边，小世界性测量广泛用于评估网络结构与功能。研究人员展示单只小鼠10个代表性神经元钙荧光信号时间序列的PCC热图；跨所有小鼠和神经元，ACA和SS区域在清醒与Dex间PCC均无显著变化。基于PCC计算小世界性，单独分析时聚类系数和平均路径长度在两个区域均无显著变化；但复合小世界性指标仅在ACA区域于Dex下显著增加，SS区域无显著变化。尽管网络结构存在差异，两区域钙瞬变变化仍相似。这表明ACA神经网络在Dex下发生改变，可能用于维持神经元活动，且小世界性增强指示神经网络重构，使网络更经济高效。
3.7 Correspondence between rPWR/rCST and the underlying neural networks：ACA中rPWR和rCST显著变化，但其钙瞬变与SS相似，提示尽管神经元活动降低，ACA网络仍适应以维持基本功能。较低rCST水平与神经网络效率相关，使功能在能量约束下保持完整。ACA与奖赏处理、决策和情绪反应等一系列关键高能耗功能密切相关。研究结果建立了rPWR/rCST与底层神经网络属性之间的对应关系：rCST反映的宏观能量利用效率提高，与微观神经网络小世界属性增强相印证。
3.8 Sensitivity analysis：敏感性分析显示，rPWR和rCST结果在所测试参数设置下高度稳定。对于lFCD敏感性分析，替代设置与主要设置的清醒-Dex差异图相关性高，区域变化方向保持不变；ACA中ΔrPWR保持正值、ΔrCST保持负值，SS中ΔrPWR和ΔrCST保持正值，但SS的ΔrCST未通过SGoF多重比较校正。对于CMRO₂敏感性分析，替代设置与主要差异图相关性至少为0.9989，空间模式高度一致；ACA中rPWR和rCST的p值均低于0.005，SS中p值范围较宽，多数未通过校正。总体表明A、β和α变化未实质性改变rPWR/rCST结果或主要发现解释。

讨论部分总结：研究发现人类和小鼠rPWR与rCST分布具有相似性。相较人类研究，小鼠模型允许检查能量利用再平衡及其可能的神经元网络组织基础。研究初步证据显示，更高的能量利用效率与神经网络重构为更经济形式相关，并证明脑经济在宏观和微观层面响应麻醉而重组。由于宏观层面可通过rPWR和rCST在人类患者中非侵入性成像，这提示此类医学成像方法可用于定位神经疾病中先于更大但不可逆改变的小而难检测变化。尽管lFCD和CMRO₂测量对所有脑区清醒与Dex状态变化高度敏感，rPWR和rCST仅在特定脑区显示显著差异，说明多数脑区在麻醉下维持相似经济谱，即使绝对能量供应和需求水平升降。ACA神经元层面结果提示，其能量经济对绝对代谢变化敏感具有生物学目的，而SS等区域不敏感。结合脑功能与代谢测量对研究神经退行性疾病很重要。ACA代谢和活动异常与精神分裂症等疾病相关，ACA还涉及神经病理性头痛。校准fMRI传统上利用气体挑战，本研究采用无气体挑战、基于弛豫测量的校准fMRI，可在单次成像中使用仅MRI扫描仪测量。Castrillon等研究通过关联葡萄糖代谢与连接性探索脑功能能量含义，强调额顶网络能量使用增加。rPWR和rCST对健康小鼠生理状态依赖的脑能量平衡敏感，可能有助于未来能量代谢和功能连接改变的脑疾病研究，但本研究未直接测试疾病模型。阿尔茨海默病日益被认为涉及葡萄糖代谢和线粒体功能障碍，前部和后部默认模式网络区域脑葡萄糖代谢降低，静息态fMRI研究报道默认模式与感觉运动网络连接下降，且阿尔茨海默病中小世界网络组织改变；精神分裂症与额叶皮层代谢受损和前额网络组织改变相关。这些观察提示此类疾病涉及代谢过程与功能网络组织的协调改变，而非单独代谢或连接改变。由于rPWR和rCST联合索引代谢供应与功能需求关系，可能为未来研究此类疾病提供有用框架，但需疾病模型和患者队列研究确定这些指标能否区分病理状态、追踪疾病进展或评估治疗反应。局限性包括：用CMRO₂替代CMRglc虽避免FDG-PET相关辐射，但测量较不直接，需要更复杂数学模型解释；白质fMRI信号弱且对噪声极敏感，尤其清醒状态，因此白质数据被排除，未来可考虑维持类清醒功能信号的更强麻醉剂；双光子钙成像动物数量有限且与fMRI实验为独立队列，尽管同一小鼠内比较清醒与Dex并重复成像，重复测量不能替代额外动物级生物学重复，颅骨手术残留效应或恢复时间差异可能影响钙成像信号，因此双光子结果应解释为MRI引导的区域特异性神经元层面证据，而非直接同动物或时间锁定验证宏观rPWR/rCST变化。

研究结论翻译：研究人员的研究提示，rPWR和rCST对生理状态变化敏感，表现出反映潜在神经网络重构的区域异质性改变。这些发现为未来研究生理和病理条件下脑功能与代谢之间关系提供了基础。