《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Integrated single-cell and metabolomic profiling identifies ovarian metabolic differences and endothelial heterogeneity associated with litter-size variation in Hu sheep
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# 摘要翻译
**背景**：湖羊具有高繁殖力，但个体间产羔数仍存在差异。卵巢代谢和体细胞异质性如何与这一差异相关联尚不清楚。研究人员采用液相色谱–质谱联用（liquid chromatography–mass spectrometry, LC–MS）和气相色
# 摘要翻译
**背景**：湖羊具有高繁殖力，但个体间产羔数仍存在差异。卵巢代谢和体细胞异质性如何与这一差异相关联尚不清楚。研究人员采用液相色谱–质谱联用（liquid chromatography–mass spectrometry, LC–MS）和气相色谱–质谱联用（gas chromatography–mass spectrometry, GC–MS）对高产羔数（high-litter-size, HLS）和低产羔数（low-litter-size, LLS）湖羊母羊的卵巢代谢物进行了分析。通过单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）表征了卵巢细胞群体及其转录状态。整合分析用于将代谢差异与特定细胞群体相关联，并预测细胞间通讯。采用反转录定量PCR（reverse-transcription quantitative PCR, RT-qPCR）和多重免疫荧光检测了选定的代谢相关基因及ESM1在内皮细胞中的定位。分别通过细胞实验评估了内皮细胞条件培养基（endothelial cell-conditioned medium, EC-CM）和重组人IGFBP3对原代绵羊颗粒细胞（granulosa cells, GCs）的影响，并利用TMEM219敲低评估受体参与情况。
**结果**：HLS卵巢中L-肉碱丰度较高，而LLS卵巢中若干代表性鞘磷脂（sphingomyelin, SM）种类丰度较高（名义P?
**结论**：本研究鉴定了探索性卵巢代谢模式与内皮细胞异质性之间的关联，功能实验表明内皮细胞来源的IGFBP3部分通过TMEM219影响颗粒细胞功能。这些发现提示内皮细胞状态和信号传导可能与卵泡发育相关，但IGFBP3–TMEM219信号是否促成湖羊产羔数变异仍有待确定。
# 论文解读文章
## 研究背景与科学问题
湖羊是我国肉羊产业中的重要地方品种，以高繁殖力著称。尽管已广泛研究了繁殖力的遗传决定因素，但品种内个体间的繁殖性能仍存在差异——生产中仍有一定比例的湖羊母羊产单羔，限制了母羊生产效率和群体盈利能力。已发现的主要繁殖力基因BMPR1B（FecB）及TGF-β、PI3K–Akt、Wnt等卵巢调控通路与湖羊繁殖力相关，但即使FecB基因型相同的母羊，产羔数仍存在变异，提示主效基因效应不能完全解释个体繁殖性能差异。卵巢为卵泡发育、卵母细胞成熟和甾体合成提供特化的微环境，代谢物作为营养物质和信号分子支持卵母细胞生长，细胞间信号也塑造该微环境。然而，湖羊中产羔数变异背后的代谢变化及其与特定卵巢细胞群体的关系仍不清楚。基于此，研究人员开展了整合代谢组学与单细胞转录组学的研究，旨在鉴定与产羔数变异相关的卵巢代谢差异，并定位可能相关的体细胞群体和通讯网络。
## 研究内容与结论概述
研究人员以高产羔数（HLS，产羔数≥3，n=3）和低产羔数（LLS，产羔数=1，n=3）的湖羊母羊为研究对象，采集全卵巢组织，分别进行代谢组学分析和单细胞RNA测序。通过代谢组与转录组的整合分析，鉴定出与差异代谢物相关的内皮细胞基因；通过内皮细胞亚聚类和代谢通路分析，定位了ESM1?血管生成型内皮细胞这一关键群体；通过细胞通讯分析预测了IGFBP3–TMEM219为候选内皮细胞–颗粒细胞互作轴；最后通过组织定位和细胞功能实验进行了验证。研究结论表明，湖羊产羔数变异伴随卵巢代谢环境和体细胞组织的差异，内皮细胞异质性及其来源的IGFBP3信号可能通过TMEM219部分介导对颗粒细胞功能的调控，但该信号是否直接决定产羔数变异仍需进一步研究。
## 主要技术方法
研究人员使用液相色谱–质谱联用（LC–MS）和气相色谱–质谱联用（GC–MS）对卵巢代谢物进行非靶向分析，以VIP>1且名义P<0.05筛选差异代谢物，并进行KEGG通路富集分析。单细胞RNA测序（scRNA-seq）用于表征卵巢细胞群体和转录状态，经过降维、批次校正和细胞注释后，使用Seurat的FindMarkers进行组间差异表达分析。整合分析采用Pearson相关算法计算差异基因表达与差异代谢物响应强度之间的相关性。内皮细胞亚聚类采用无监督聚类并结合典型标记基因注释。细胞间通讯分析使用CellChat（基于人类配体–受体数据库）和NicheNet进行通路比较和配体优先化。功能实验包括多重免疫荧光染色（ESM1和VWF）、RT-qPCR、Western blotting、EdU掺入实验，使用人卵巢微血管内皮细胞（HOMECs）来源的条件培养基（EC-CM）和重组人IGFBP3（rhIGFBP3）处理原代绵羊颗粒细胞，并通过shRNA敲低TMEM219评估受体参与。样本来源于陕西省榆林新中盛农牧发展有限公司的6只发情湖羊母羊。
## 研究结果
### 代谢组学分析鉴定卵巢差异代谢物
PCA分析显示HLS和LLS两组在GC–MS和LC–MS数据中未见明显分离，但同组生物学重复呈现聚集趋势。以VIP>1和名义P<0.05为标准，GC–MS筛选出20个在HLS卵巢中丰度较高的候选代谢物，LC–MS鉴定出130个丰度较高和88个丰度较低的候选代谢物，但这些候选在BH校正后均无统计学显著性，因此被视为产生假说的探索性结果。代表性代谢物中，HLS卵巢L-肉碱丰度较高，而LLS卵巢多种鞘磷脂（SM）种类如SM(d16:1/17:0)、SM(d18:0/16:1(9Z))和SM(d18:1/16:1(9Z))丰度较高。KEGG分析显示GC–MS差异代谢物富集于脂肪酸生物合成、β-丙氨酸代谢、嘧啶代谢和酪氨酸代谢；LC–MS数据富集于17条代谢通路，包括赖氨酸降解、甘油磷脂代谢、坏死性凋亡和色氨酸代谢。
### 代谢物与单细胞转录组的整合分析
相关分析显示DNAJB4和NDRG1与多种关键差异代谢物存在强相关。利用scRNA-seq数据检查细胞类型特异性表达发现，DNAJB4主要表达于内皮细胞（ECs）和基质细胞（SCs），而NDRG1特异富集于ECs。组间比较显示DNAJB4在LLS组表达较高，NDRG1在HLS组表达较高。组织qPCR验证NDRG1 mRNA在HLS母羊中显著高于LLS母羊（P<0.05），提示内皮细胞的代谢和转录改变可能与HLS和LLS母羊的卵巢差异有关。
### 细胞类型特异性功能富集和代谢分析
在先前鉴定颗粒细胞为重要体细胞群体的基础上，整合分析进一步将ECs和SCs与组间卵巢差异相关联。通路富集分析显示“核糖体”通路主要富集于颗粒细胞，“黏着斑”和“ECM–受体相互作用”富集于基质细胞和血管周细胞。HLS组基质细胞中氧化磷酸化、蛋白酶体和柠檬酸循环（TCA循环）显著激活，ECM–受体相互作用受抑制；颗粒细胞中萜类骨架生物合成、核糖体和甾体生物合成显著激活。ECs中谷胱甘肽代谢和氧化磷酸化显著激活，GSEA进一步确认这些通路在HLS组ECs中稳健富集（谷胱甘肽代谢NES=2.03，P<0.01；氧化磷酸化NES=1.96，P<0.01）。谷胱甘肽合成基因GCLC、GSS和线粒体基因ATP5F1A、ACO2、SDHA在HLS组ECs中表达更高。组织qPCR验证ATP5F1A在HLS中显著升高（P=0.018），GCLC呈升高趋势（P=0.061）。
### 卵巢ECs的亚群异质性与代谢轨迹分析
对内皮细胞进行无监督亚聚类，鉴定出6个亚群：炎症型内皮细胞（I-EC，CXCL9）、血管生成型内皮细胞（A-EC，ESM1）、毛细血管内皮细胞（C-EC，HOPX）、内皮–间质转化样内皮细胞（E-EC，COL1A1）、动脉内皮细胞（R-EC，GJA5）和淋巴管内皮细胞（L-EC，CCL21）。代谢基因表达热图显示谷胱甘肽合成基因（GCLC、GCLM、GSS）和脂肪酸氧化基因（ACACA、ACACB）在亚群间存在显著异质性，且HLS组特定EC亚群中这些基因表达普遍升高。伪时间轨迹分析推断出分支分化路径，A-EC局限于早期state 3，C-EC集中于后期state，E-EC位于过渡生态位。分支表达分析（BEAM）显示细胞命运1相关基因簇富集于ATP生物合成、质子动力驱动的线粒体ATP合成和氧化磷酸化（含ATP5F1A、NDUFV1），细胞命运2相关基因簇富集于Wnt信号通路和结缔组织发育。GCLC和GCLM沿伪时间的表达在HLS组整体更高且更持续。研究人员还鉴定出CCN1、CITED4、DHCR24等分支依赖的转录因子和标记基因。
### A-EC亚群的单细胞代谢通量分析
单细胞代谢通路评分显示阿ECs在酪氨酸和色氨酸代谢上与其他细胞类型明显不同；谷胱甘肽代谢、氧化磷酸化和鞘磷脂代谢在空间上富集于内皮细胞。定量比较显示HLS组A-ECs在谷胱甘肽代谢（P<0.01）、氧化磷酸化（P<0.01）和鞘磷脂代谢（P<0.01）方面与LLS组差异显著。scFEA预测的通量图谱显示明确的细胞类型特异性模式，A-ECs在葡萄糖和TCA循环相关反应（如“丙酮酸→乙酰辅酶A”“柠檬酸→2-酮戊二酸”）中具有独特通量特征。差异通量分析显示“丝氨酸→丙酮酸”和“谷胱甘肽→谷氨酸”通量在两组间差异显著（P<0.05），表明不同繁殖力绵羊A-ECs中能量代谢和抗氧化代谢通量发生深刻重塑。
### HLS与LLS组间细胞间通讯及配体–受体互作差异
CellChat分析显示LLS组推断相互作用总数（556对）略高于HLS组（513对），但总互作强度相当。相对信息流比较显示WNT、CCL和BMP信号在HLS组更突出，而GAS、SLIT和TGFβ信号在LLS组更显著。限制分析到A-ECs作为发送细胞时，其与多个卵巢细胞群体的预测通讯在HLS组普遍增强。通路水平比较显示A-ECs的传出和传入信号发生组依赖性变化，涉及PTN、IGF、VEGF、TGFβ、SPP1和WNT等通路。配体–受体水平分析鉴定出IGFBP3–TMEM219为候选互作对。NicheNet分析以6个EC亚群为发送细胞、颗粒细胞为接收细胞，优先化出TGFB1、BMP7和VEGFA等候选配体及其预测靶基因。
### 内皮细胞来源IGFBP3对颗粒细胞的功能评估
多重免疫荧光显示ESM1与VWF阳性血管结构共定位。HLS卵巢中ESM1阳性面积显著更大（17.41%±1.68% vs. 12.41%±2.40%，P=0.042），VWF?ESM1?双阳性细胞数也更多（23.33±2.02 vs. 10.17±7.52，P=0.043）。样本水平单细胞分析显示HLS组内皮细胞（包括A-ECs）中IGFBP3表达数值较低，但差异未达统计学显著；颗粒细胞中TMEM219表达组间相当。功能实验中，EC-CM处理显著降低颗粒细胞EdU掺入强度（P=0.013），降低CYP11A1（P=0.009）、FSHR（P=0.003）和STAR（P<0.001）的mRNA表达，同时升高细胞IGFBP3和TMEM219蛋白丰度（P=0.008和0.002）。在对照转染的颗粒细胞中，rhIGFBP3降低了EdU强度及CYP11A1、FSHR和STAR表达；TMEM219敲低单独处理则升高这些指标，且TMEM219敲低部分减弱了rhIGFBP3的效应。
## 总结讨论与结论翻译
**讨论总结**：本研究表明湖羊产羔数变异与卵巢代谢微环境和体细胞功能异质性相关。代谢组学鉴定出探索性的肉碱和鞘磷脂组成差异，整合分析将内皮细胞定位为重要关联群体。ESM1?A-ECs在HLS卵巢中呈现独特的代谢状态，组织学验证支持其与HLS表型的关联。IGFBP3–TMEM219被鉴定为候选内皮–颗粒细胞通讯通路，功能实验表明内皮细胞来源的IGFBP3抑制颗粒细胞增殖和甾体合成相关基因表达，且部分依赖于TMEM219。研究存在样本量小、代谢物差异未通过多重检验校正等局限性，未来需扩大样本量并结合排卵率和胚胎存活率记录进一步验证。
**结论翻译**：本研究表明，湖羊产羔数变异伴随卵巢代谢环境和体细胞组织的差异。代谢组学分析鉴定出HLS与LLS母羊之间探索性的卵巢肉碱和鞘磷脂组成差异。与单细胞转录组数据的进一步整合将这些代谢差异与内皮细胞异质性相关联。功能实验显示，内皮细胞来源的和重组的IGFBP3抑制颗粒细胞增殖和甾体合成相关基因表达，且TMEM219参与了这些效应。综上所述，这些发现将内皮细胞异质性与与卵泡发育相关的卵巢代谢状况联系起来，并确定了IGFBP3–TMEM219为功能性内皮细胞–颗粒细胞信号通路。该通路是否促成产羔数变异仍需确定。本研究为理解湖羊高繁殖力提供了细胞和代谢视角，并为繁殖评估和育种研究提供了新方向。
