《Biomarker Research》：The immune phenotype of circulating tumor cells: from escape mechanisms to immunotherapy navigation
循环肿瘤细胞（CTCs）在形成远处转移前必须逃逸血流中的免疫攻击。其免疫表型（包括检查点配体、抗原呈递分子及免疫调节特征）可通过连续血液采样进行评估，并可能提供与现有免疫治疗生物标志物互补的信息。本综述按血管内渗、循环转运及定植三个阶段梳理CTCs的免疫逃逸机制，同时区分直接针对CTCs的观察结果与源自肿瘤组织、细胞培养或动物模型的证据，并系统分析CTCs相关的免疫相互作用。研究人员综述了免疫表型分析技术，以及跨癌种将CTC免疫特征与免疫治疗结局相关联的临床证据。现有研究支持进一步探索纵向CTC监测，但检测方法异质性、队列规模较小或回顾性设计、以及前瞻性验证不足，限制了依据这些读数进行常规治疗决策的应用。此外，研究人员还讨论了在血管转运期间破坏CTC免疫保护的实验策略，并提出了从发现与分析验证到临床效用及实施的四阶段路径。CTC免疫表型分析仍属于研究策略，其临床价值必须在组织生物标志物、循环肿瘤DNA（ctDNA）及标准临床评估之外加以确立。
**引言**
转移是癌症相关死亡的主要原因，约占全球癌症死亡的90%。循环肿瘤细胞（CTCs）是转移过程的核心，它们是从原发或转移性肿瘤脱落并进入血流、具有定植远处器官潜能的癌细胞。自1869年Thomas Ashworth首次描述以来，CTCs已从病理学 curiosities 发展为经临床验证的生物标志物；通过FDA批准的CellSearch系统进行计数，已被确立为转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的独立预后指标。
免疫检查点抑制剂（ICIs）通过阻断抑制性受体-配体相互作用（如PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7）扩展了癌症治疗手段。抗PD-1/PD-L1疗法可在多种恶性肿瘤中产生持久获益，包括非小细胞肺癌（NSCLC）、黑色素瘤和尿路上皮癌。然而，获益在不同癌种、治疗方案和患者群体间存在差异，可靠预测性生物标志物仍是临床需求。
当前免疫治疗生物标志物提供了有用但不完整的信息。组织PD-L1免疫组织化学（IHC）受空间和时间异质性、活检取样以及抗体克隆和评分系统差异的影响。肿瘤突变负荷（TMB）和微卫星不稳定性（MSI）描述了肿瘤生物学的其他方面，但这些测量不能直接表征完整循环肿瘤细胞的免疫表型。因此，连续CTC评估可作为治疗期间细胞水平免疫变化的补充信息来源进行探究。
连续血液采样使CTC免疫表型分析成为治疗期间监测选定肿瘤细胞状态的候选方法。CTCs是暴露于肿瘤微环境（TME）和循环中免疫压力的选定亚群，因此其表型不必重现原发肿瘤的表型。候选读数包括免疫检查点配体如PD-L1、CD47、B7-H3和HLA-G，抗原呈递分子及其他免疫调节特征。对HLA-E–CD94/NKG2A和HLA-C–KIR轴的研究也表明，固有免疫识别与T细胞检查点同样值得关注。这些测量是否能改善免疫治疗反应的预测或监测，需要疾病特异性的临床验证。
既往综述已描述CTC生物学、免疫逃逸和转移播散。在此，研究人员围绕三个问题整合这些主题：免疫压力在播散过程中如何变化，哪些CTC相关免疫特征可以测量，以及需要何种证据才能将这些测量用于免疫治疗研究。研究人员按播散阶段组织免疫逃逸机制，检查CTCs与免疫细胞间的相互作用，并评估跨癌种的候选生物标志物。患者来源CTCs的直接观察与细胞培养或动物模型中的功能研究以及肿瘤组织中的发现相区分。这些来源回答不同问题：在CTCs上检测到标志物并不能确立其功能作用，而在模型中证明机制也不能确立其在患者中的预测价值。这一区分指导临床证据的解释和拟议的验证路线图。
通过将重点从CTC计数转向CTC免疫表型分析，本综述将循环肿瘤细胞视为肿瘤-免疫相互作用的动态窗口。这一视角尚未确立CTC免疫表型分析作为常规临床决策工具，但阐明了测试其转化价值所需的生物学原理、技术要求和验证步骤。
**CTC免疫逃逸的阶段解析机制**
CTCs从原发肿瘤到远处转移的转运是一个多步骤过程，其中免疫压力因阶段而异。在脱落和血管内渗、循环存活以及外渗和定植过程中，肿瘤细胞遇到不同的免疫效应群体和保护性相互作用。本节遵循这些阶段，区分血管进入前作用的机制与在血液或转移部位作用的机制。图1聚焦于循环转运期间的免疫逃逸机制。
**脱落和血管内渗：逃逸局部免疫监视**
在脱落和血管内渗期间，免疫逃逸可在血管进入前开始。原发TME内的免疫编辑可能选择免疫原性降低、抵抗免疫攻击能力增强的细胞。原发肿瘤与CTCs的比较（包括单细胞分析）识别出抗原呈递和干扰素反应程序的差异，与这一可能性一致。此类比较本身并不能确定每种表型何时获得。它们支持将免疫逃逸视为播散前选择和转运期间适应的组合，而非假设所有逃逸程序仅起源于血流中。
第二个促成因素是上皮-间质可塑性，它将物理播散与免疫逃逸联系起来。除了增加运动和侵袭外，EMT相关程序可减少抗原呈递、增加检查点配体表达，并将CTCs转向与转移能力相关的杂交上皮-间质状态。CTC聚焦研究还将间质特征与通过N-钙黏蛋白依赖性信号和基质cGAS-STING-IFN-γ-HLA串扰改变NK细胞敏感性联系起来。这些发现表明可塑性可改变循环细胞可用的免疫逃逸途径；它们并未确立单独使用EMT状态作为选择免疫治疗的标志物。
**循环转运期间的存活**
进入血流后，CTCs同时暴露于多种压力源。除了血流动力学剪切和失巢凋亡外，它们还遇到完整的循环免疫效应谱：自然杀伤（NK）细胞、单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞、γδT细胞和补体。CTCs的估计循环半衰期为1–2.4小时，反映了强大的选择压力。CTCs在此间隔内存活的策略分为两组：细胞内在机制和利用血液成分的细胞外在机制。
**细胞内在免疫逃逸机制**
PD-L1仍是CTCs上研究最深入的免疫检查点配体。其表达已在多种癌种中报道，且可能与匹配组织PD-L1状态不同，尽管生物学异质性和检测差异均影响这一比较。CD47通过SIRP-α轴将CTC表型分析与巨噬细胞吞噬作用联系起来。HLA-G、HLA-E–CD94/NKG2A、CD155–TIGIT和囊泡相关免疫调节代表额外候选途径，具有不同程度的直接CTC证据。这些途径应相互区分，并与临床验证的生物标志物区分。
MHC I类（HLA I类；以下简称MHC-I）的丢失或重塑可减少细胞毒性T细胞的识别，而抑制性MHC-I信号的丢失可增加NK细胞“缺失自我”识别的易感性。结果取决于激活和抑制信号的平衡，包括保留非经典MHC分子和其他NK抑制性配体。悬浮存活增加另一层面：失巢凋亡抵抗和剪切应力适应本身不是免疫逃逸机制，但可影响对压力和细胞死亡的易感性。因此，其贡献应与检查点和抗原呈递变化一起评估，而非仅从存活标志物推断。
**细胞外在免疫逃逸机制**
血小板 cloak 是CTCs最具特征的外在保护盾，通过至少三条非排他性途径运作。首先，活化血小板在血管内渗后不久粘附于肿瘤细胞表面，形成物理外壳，减少活化配体对NK细胞受体的可及性。其次，血小板将血小板来源的MHC I类转移至肿瘤细胞膜，产生伪正常表面表型，抑制“缺失自我”识别；在实验系统中，当这种转移被阻止时，NK细胞反应性得以恢复。第三，血小板释放物（包括TGF-β和其他可溶性介质）削弱NK细胞效应功能，而血小板和纤维蛋白（原）依赖性聚集在体内阻碍NK细胞介导的肿瘤细胞消除。血小板支持的CD155–TIGIT信号提供了另一条受体水平途径，通过该途径血小板–CTC界面抑制NK杀伤。这些机制同时作用于识别、抑制信号和物理可及性，这可能解释了为什么靶向单一血小板衍生介质的方法不如针对血小板–CTC相互作用本身的方法有效。大多数证据来自实验模型和离体共培养，而非患者来源CTCs，且患者中携带血小板外壳的CTC比例尚未系统量化。
中性粒细胞提供第二个保护界面，支持证据分为两个机制上不同且常被混淆的臂。第一是细胞 escort。对乳腺癌患者和小鼠模型中CTC–中性粒细胞簇的单细胞分析显示，中性粒细胞相关CTCs携带促进细胞周期进程的转录程序，且此类簇比单独旅行的CTCs更有效地播种转移。第二臂是NET介导的。全身炎症或手术后释放的中性粒细胞胞外陷阱（NETs）将CTCs sequester 在肝和肺微血管中，促进粘附和外渗，且CXCR1/CXCR2驱动的NET形成可额外保护肿瘤细胞免受接触依赖性细胞毒性。NETs也被证明通过层粘连蛋白重塑唤醒休眠播散细胞。更近期的工作识别了这些事件的上游调节因子，包括将手术应激与NET介导的CTC捕获耦合的血小板TLR4–ERK5信号，以及结直肠癌中周细胞驱动的CTC–中性粒细胞簇形成。将 escort 与 entrapment 分离在治疗上和概念上都很重要：溶解NETs和预防簇形成预测对免疫暴露的不同影响，且移除NET屏障的干预不一定会分离含中性粒细胞的簇。
髓源性抑制细胞（MDSCs）和调节性T细胞（Tregs）也与多种癌症中较高的CTC负荷和较差预后相关。在某些情况下，CTCs可能通过释放细胞因子、细胞外囊泡或血小板激活信号促进这种更广泛的免疫抑制环境，但目前最强证据支持双向关联，而非简单的CTC免疫抑制途径。根据现有证据，CTCs很可能受益于并在某些情况下促成全身免疫抑制环境，但因果关系方向仍未解决。
**CTC簇和集体免疫保护**
同型和异型CTC簇比单个细胞更有效地在循环中存活，部分优势是免疫性的而非纯粹机械性的。聚集重塑甲基化、干性和应激适应程序，而外层细胞、相关血小板和招募的中性粒细胞可减少内部细胞暴露于剪切应力和免疫杀伤。异型CTC簇的存在因此加强了将CTCs作为免疫生态单元而非孤立肿瘤细胞研究的理由。它也具有方法论后果：簇聚焦检测应保留细胞-细胞结构，而非将簇还原为单细胞标志物平均值。
**转移部位的外渗和定植**
在转移部位，免疫背景决定播散细胞是被消除、保持休眠还是进展。转移前微环境形成和休眠-免疫平衡提供了循环免疫逃逸与转移生长之间的概念桥梁。高分辨率成像和机制研究表明，早期播散细胞迅速与局部固有和适应性免疫程序相互作用，包括氧感应T细胞状态和影响免疫杀伤抵抗的肿瘤细胞内在程序。这些观察支持保守结论：CTC免疫表型可能偏向后期定植，但该领域仍需要直接纵向证据连接基于血液的CTC免疫状态与转移微环境结局。
综合来看，播散期间的免疫逃逸涉及重叠机制，其相关性随解剖背景而变化。在血管进入前，免疫编辑和上皮-间质可塑性可能影响可用于播散的细胞。在循环期间，检查点表达、抗原呈递改变、血小板相互作用、中性粒细胞合作和聚集可提供互补保护。在外渗后，局部免疫压力和休眠程序影响播散细胞是被消除、控制还是扩增。图1总结了这一框架中循环聚焦部分。基于阶段的组织为候选脆弱性的实验测试提供了理由，但并未确立哪种干预在患者中有效。
**CTCs作为主动免疫调节因子**
CTCs可在播散期间与免疫细胞进行双向相互作用，支持证据分为在直接 implicating 循环细胞本身方面差异很大的类别。直接接触和异型簇的证据因此与细胞外囊泡（EVs）和可溶性介质研究分开考虑，后者在血液中的细胞来源通常难以确定。这一区分是必要的，因为与CTC负荷相关的全身免疫变化并不能确立CTCs导致了该变化：原发和转移灶、基质区室和宿主免疫系统都贡献于同一循环池，且CTCs仅代表其中数量极微小的部分。因此，以下小节从支持最充分的相互作用（其中CTC可物理识别）向解析度最低的相互作用（其中归因于CTCs仍属推断）移动。
**CTC相关细胞外囊泡在免疫调节中的作用**
细胞外囊泡（EVs）提供了肿瘤细胞超越直接接触影响免疫细胞的机制。肿瘤来源和循环EVs可携带PD-L1、NKG2D配体、细胞因子调节货物和其他免疫活性分子。在CTC背景下，最强的主张不是大多数循环EVs是CTC来源的，而是CTCs存在于EV介导免疫调节发生的相同血管区室中。EV来源CD45可 coating CTCs 并削弱TCR信号的近期证据进一步支持直接的囊泡-CTC免疫逃逸界面。CTCs与原发或转移性肿瘤沉积物对EV池的相对贡献仍未解决。
**CTC相关细胞因子和趋化因子信号**
可溶性因子提供了CTCs与全身免疫状态之间的另一可能联系。肿瘤和基质生物学研究 implicating TGF-β、IL-6/STAT3、VEGF和趋化因子途径在树突状细胞成熟受损、髓样细胞招募和效应活性降低中的作用。这些发现为研究循环环境提供了理由，但并未显示CTCs是所测量因子的主要来源。原发肿瘤、转移沉积物、基质细胞和免疫细胞也可能贡献。归因于CTC分泌需要来源解析实验；单独的血浆浓度或与CTC计数的相关性不能确立该起源。
**接触依赖性免疫细胞重编程**
除了可溶性和囊泡信号外，CTCs还可在播散期间通过直接物理接触重编程免疫细胞。最清晰的证据来自异型簇，其中与免疫细胞的直接 apposition 可从细胞毒性界面转变为促转移界面，以及依赖与巨噬细胞在定植期间相互串扰的间质CTC程序。这些接触依赖性相互作用在机制上不同于EV或细胞因子介导效应，因为它们需要保留细胞-细胞结构，因此最好在避免强制解离的检测中研究。保持这一区分将焦点保持在可测量的CTC相关免疫相互作用上，并避免将全身免疫功能障碍过度归因于罕见的循环群体。
**CTC相关全身免疫状态和转移前微环境**
图2区分直接CTC相关相互作用与更广泛的肿瘤相关信号和全身免疫观察。CTC负荷与循环淋巴细胞或NK细胞群体之间的关联并不能解决CTCs驱动免疫功能障碍还是反映疾病负担和周围免疫环境。肿瘤来源EVs可在实验模型中有助于转移前微环境形成，但这些发现并未确立患者中CTC来源EVs的等效贡献。CTC分析在与免疫细胞测量和功能研究配对时可能有助于研究这种关系；不应将其解释为CTC介导全身免疫抑制的独立测量。
**CTC免疫表型分析的技术创新**
CTC免疫表型分析受限于低细胞丰度、捕获偏倚、标志物不稳定性和跨平台可比性有限。这些限制并非独立：为最大化回收而选择的捕获方法可能同时选择表型，为保留形态而选择的固定方案可能损害待测表位。因此，检测选择应遵循感兴趣的免疫特征——表面蛋白、抗原呈递状态、转录组程序、功能性免疫易感性或纵向变化——而非平台可用性。图3将富集和回收与下游读数分离，并总结了每个阶段的实际限制。这是检测角色的定性比较，而非评分性能排名，以下小节讨论每类方法能解析和不能解析的内容。
**基于抗体的CTC免疫标志物检测**
基于抗体的平台仍是CTC免疫表型分析的实际切入点，因为它们可将已建立的上皮或谱系捕获策略与临床可解释的免疫标志物连接起来。其价值不仅在于分析灵敏度，还在于保留肿瘤细胞身份与免疫调节蛋白（如PD-L1、MHC-I/HLA-I、CD47或免疫谱系排除标志物）之间空间共定位的能力。因此，本小节区分以计数为中心的临床系统与提供更丰富表型背景但需要更强标准化的多重成像方法。
**CellSearch平台：能力与限制**
CellSearch系统提供最标准化的上皮CTC计数临床框架，使用EpCAM介导富集，随后进行细胞角蛋白、DAPI和CD45染色。其第四荧光通道已被适配用于PD-L1和其他免疫标志物，使其适用于单标志物临床研究。然而，相同架构限制了免疫表型分析：基于EpCAM的捕获低估间质或杂交CTCs，且单个额外通道无法解析PD-L1、MHC-I、CD47、B7-H3或EMT状态的协调变化。较新的富集和纳米颗粒检测改善表型可塑性CTCs的检测，但大多数仍为平台演示，而非临床标准化的免疫表型分析工作流程。因此，CellSearch来源的免疫读数应解释为标准化但不完整的循环区室测量。
**多参数免疫荧光、流式细胞术和质谱流式**
多参数免疫荧光、流式细胞术和质谱流式将CTC分析从单标志物阳性扩展到协调免疫表型。免疫特征应在实际测量的水平上解释。在下面讨论的HNSCC队列中，PD-L1 mRNA通过RT-qPCR在EpCAM富集的CTC组分中定量；该读数不同于细胞解析的蛋白质成像。流式细胞术和CyTOF可测量更大的标志物面板，但其价值取决于富集策略、事件回收以及区分稀有CTCs与白细胞背景的能力。这些平台是互补的读数策略而非竞争设备：成像在形态相关标志物定位方面最强，基于流式的方法在表面标志物广度方面最强，CyTOF在探索性高维分析方面最强。
**单细胞多组学技术**
当CTC免疫表型不能简化为表面标志物调用时，单细胞多组学最为有用。CTC转录组研究揭示了免疫检查点程序、抗原呈递机制、干扰素反应状态和转移能力方面的患者水平和样本内异质性，而更近期的表型分析工作强调这些状态即使在同一次血液抽取中也可能显著不同。蛋白质-转录组方法如CITE-seq有助于弥合mRNA和表面蛋白丰度之间的差距，相关单细胞平台提供了将免疫标志物状态与功能异质性联系起来的框架。当前限制是转化性的而非概念性的：成本、细胞回收、批次效应和稀疏细胞数仍阻碍常规临床实施。
**微流控技术和活细胞捕获**
鉴于微流控平台维持细胞活力，它们也促进功能性免疫检测。静态标志物分析无法确定CTCs是否抵抗NK细胞杀伤、抑制T细胞活化或逃避巨噬细胞吞噬。因此，活细胞捕获平台通过实现与免疫效应细胞共培养和下游活力或细胞毒性检测增加功能信息。CTC来源培养物和离体模型通过允许重复测试抗原呈递动力学、IFN-γ反应性、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）敏感性和药物-免疫组合扩展这一逻辑。这些模型难以建立，可能选择培养适应亚群；它们仍是功能性假设检验系统，而非常规临床检测。
**技术挑战和标准化需求**
临床转化将较少依赖于添加新捕获设备，而更多依赖于减少分析前和分析变量。关键变异来源包括血液体积、处理延迟、富集偏倚、抗体克隆、阳性阈值以及读数是否按细胞、按患者或纵向评分。CTC PD-L1检测说明了问题：研究在克隆选择、染色工作流程、强度阈值以及是否排除血小板/白细胞相关信号方面不同。可能需要类似于组织PD-L1可比性工作的协调，但CTC特异性标准也必须考虑稀有性、EMT相关标志物丢失和平台依赖性回收。在此类标准存在之前，CTC免疫表型分析应报告平台、阈值、分母和采样时间信息。
**CTC免疫表型作为免疫治疗生物标志物：跨癌种证据**
本节评估将CTC免疫表型与免疫治疗结局联系起来的证据。三个区分组织评估，因为混淆它们是该文献中最常见的夸大来源。直接CTC研究区别于组织、ctDNA、EV和一般免疫治疗研究，因为组织中确立的机制不会自动转移到循环区室。预后关联与治疗获益预测分离，后者需要治疗-生物标志物相互作用，因此需要比较组。连续监测与基线测试分开评估，因为两者回答不同临床问题并具有不同证据要求。图4总结了可用证据类型和仍未解决的问题，而不分配数值证据评分或治疗建议。
**CTC PD-L1表达与ICI疗效预测**
PD-L1阳性CTCs最好被视为检查点生物学的动态液体活检相关因素，而非组织PD-L1免疫组织化学的直接替代物。核心问题是CTC上的PD-L1是否增加了关于空间异质性、时间免疫适应或治疗出现耐药的信息，而这些是静态肿瘤组织无法捕获的。回答它需要特定种类的证据：不仅仅是CTC和组织结果不同（采样和分析变异本身即可产生），而且是CTC测量在考虑组织PD-L1和临床因素后追踪结局。很少有研究设计来直接回答该问题。因此，以下小节在比较CTC PD-L1与组织检测前，先区分NSCLC、乳腺癌和其他肿瘤类型的证据。
**非小细胞肺癌（NSCLC）**
NSCLC仍是CTC PD-L1的主要临床环境，因为ICIs是治疗核心且晚期疾病常产生可检测CTCs。早期研究将PD-L1阳性CTCs与PD-1阻断期间较差结局联系起来，但平台和阈值异质性限制其作为独立治疗选择器的使用。有限纵向研究表明，治疗期间PD-L1阳性CTCs的动态变化可能比单一基线测量更具信息量。因此，当前最强解释是纵向风险监测，而非替代组织PD-L1或既定临床决策标志物。
**乳腺癌和选定非NSCLC肿瘤类型**
在乳腺癌中，早期工作确立了PD-L1可在CTCs上检测到，特别是在转移性疾病中。免疫治疗队列分析提示与结局可能相关，但亚型、治疗方案和检测平台影响解释。在接受诱导化疗和同步放化疗的局部晚期头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中，治疗结束时EpCAM富集CTC组分中PD-L1过表达与较差结局相关；该研究未评估对PD-1阻断的反应。肝细胞癌和肾细胞癌研究也支持疾病特异性研究，而非跨癌种使用CTC免疫表型。
**PD-L1阳性CTCs作为预测性生物标志物的跨癌种比较**
表1总结的研究支持跨癌种调查CTC PD-L1，但未确立共同预测阈值。报告的阳性和结局关联因疾病、治疗环境、富集方法和评分定义而异。连续测量可能捕获基线样本遗漏的信息，但其附加价值需要针对标准临床和生物标志物评估进行前瞻性测试。与组织PD-L1的不一致可能反映区室间的生物学差异以及采样和分析变异；它本身并不证明更高的预测准确性。
**CTC PD-L1与组织PD-L1：一致性与互补性**
CTC PD-L1和组织PD-L1测量采样不同区室，在时间和评分系统上可能不同。组织IHC表征采样肿瘤组织，而CTC检测检查选定循环细胞；生物学和分析差异均影响其比较。联合评估可能提供互补研究信息，但前瞻性证据不足以使用双阳性或双阴性模式作为治疗选择规则。潜在的互补研究角色是时间性的：连续CTC PD-L1测量可与基线组织PD-L1一起测试，以确定它们是否增加关于治疗相关变化的信息。这一可能性并未确立临床效用。
**超越PD-L1：新兴CTC免疫生物标志物**
虽然PD-L1主导CTC免疫表型分析文献，但PD-L1作为预测性生物标志物的局限性（不完全灵敏度和特异性、动态调节、平台依赖性检测）已推动探索CTCs上的其他免疫标志物（表2）。这一探索是及时的，因为靶向多种免疫途径的免疫治疗药物库正在扩展，创造了将循环免疫表型与更特异性治疗假设匹配的机会。在直接CTC特异性队列数据仍有限的情况下，表2应被视为转化和机制图谱，而非临床验证的选择标志物列表。
超越PD-L1，临床上最合理的CTC免疫标志物是那些将可测量循环表型与可操作治疗免疫轴连接起来的标志物。CD47是最清晰例子，因为CTC CD47表达将巨噬细胞吞噬、SIRP-α信号和抗CD47策略联系起来。B7-H3作为CTC生物标志物仍处于早期阶段；当前证据支持将其纳入多重面板，但尚未支持其作为独立治疗选择标志物。HLA-I/II状态可指示CTCs是否仍对T细胞介导疗法可见，尽管大多数支持证据仍来自肿瘤组织或更广泛的免疫治疗研究，而非直接CTC队列。糖基化和Siglec相关免疫抑制代表新兴表面表型层，但在更强CTC特异性验证可用之前应视为探索性。
**CTC免疫表型的纵向动态监测**
重复采样是CTC分析的实际优势，但纵向解释取决于治疗环境和检测回收的肿瘤细胞表型。PD-L1阳性CTC的变化可作为候选药效学或风险标志物进行研究；下降本身并不确立治疗获益。聚集、抗原呈递丢失和CD47信号的实验研究也激发对耐药相关CTC状态的研究，尽管它们未验证基于CTC的二线治疗算法。前瞻性研究必须确定这些测量是否在总CTC负荷、影像学和既定生物标志物之外增加信息。
**CTC计数和免疫表型的联合分析**
CTC计数和免疫表型应一起解释。高CTC计数伴随PD-L1、CD47、低HLA-I或簇富集提示肿瘤负荷和主动免疫逃逸，而稀有或下降CTC上的免疫标志物阳性可能具有不同含义。这种联合解释也有助于区分高风险生物学状态与CTC负荷的纯数量上升。簇分数可增加信息，因为簇显示集体存活和免疫保护特征，但这仍是研究变量而非验证的免疫治疗选择标准。
**将CTC免疫信息与其他液体活检分析物整合**
与其他液体活检分析物的整合在最有用时，每种分析物回答不同问题。循环肿瘤DNA（ctDNA）可通过基于血液的TMB或选定免疫耐药改变估计肿瘤免疫原性，而CTCs报告细胞水平免疫逃逸和转移能力。外泌体PD-L1提供全身PD-L1暴露的可溶性/囊泡测量。实践中，联合面板的价值将取决于每种分析物是否在单纯CTC计数之外改变对反应、耐药或转移风险的解释。因此，实用的未来面板应基于假设驱动和纵向设计，而非可用分析物的最大列表。
**靶向CTC免疫脆弱性的治疗策略**
CTC免疫表型的治疗性利用不如生物标志物开发成熟，但它提供了有用的转化框架。最合理的策略不仅将CTCs作为孤立细胞靶向；它们靶向允许CTCs抵抗免疫清除的保护性界面，包括效应细胞识别受损、血小板和NET屏蔽、巨噬细胞检查点信号和簇介导存活。因此，本节将CTC免疫脆弱性视为一组可靶向状态，而非单一治疗靶点（表3）。
**增强免疫效应细胞杀伤CTCs**
CTC转运使肿瘤细胞暴露于循环免疫效应物，并提供了测试旨在减少转移播种的干预措施的实验环境。NK定向方法需要注意激活信号和抑制途径，包括NKG2A。候选策略包括抗体依赖性细胞毒性、工程效应细胞、免疫细胞衔接器和检查点阻断，但支持研究通常涉及肿瘤模型或非CTC临床环境。其与CTC清除的相关性因此必须直接测试。单独低MHC-I并不能确立对NK细胞治疗的敏感性或识别适当衔接器；靶抗原表达、效应能力
和抑制信号也需要评估。
**破坏CTC免疫保护盾**
几种CTC免疫逃逸机制依赖外在保护盾而非固定肿瘤细胞内在程序。血小板、纤维蛋白、中性粒细胞胞外陷阱和巨噬细胞检查点轴都可在血管转运期间产生瞬时保护，使其成为有吸引力但生物学上微妙的靶点。其吸引力在于它们原则上可逆：与抗原呈递机制的基因组丢失不同，血小板外壳或NET可通过药理学方式移除而不改变肿瘤细胞本身。其微妙之处在于每个保护盾由具有止血和宿主防御基本功能的生理系统构建。因此，治疗挑战是削弱这些保护界面以恢复免疫清除，而不引起不可接受的出血、炎症或脱靶免疫毒性。
**血小板和NET保护盾破坏**
血小板 cloak 和NETs具有吸引力，因为它们是外在保护盾而非固定肿瘤细胞特征。抗血小板策略在减少转移风险方面有流行病学和实验支持，但其临床转化必须在CTC免疫暴露和出血风险之间取得平衡。工程血小板或血小板模拟系统仍是拦截CTCs或重塑血小板介导微环境的概念验证工具，而非近期临床标准。NET靶向策略，包括基于DNase的降解或抑制NET形成，可能类似地使CTCs暴露于免疫攻击并减少转移性 trapping。这些方法最好作为保护盾破坏辅助手段讨论，而非独立抗CTC疗法。
**抗CD47/SIRPα阻断**
CD47-SIRPα信号为研究巨噬细胞吞噬抵抗提供了理由，但来自实体瘤模型和非CTC临床研究的证据并未确立CTC CD47作为治疗选择生物标志物。CD47和PD-L1联合阻断有实验支持，激发将标志物共表达与功能易感性联系起来的研究。CTC CD47可在此类试验中作为分层或药效学变量进行评估。表达本身不应被用来预测获益，特别是因为治疗靶向必须考虑正常细胞上的CD47表达。
**解离CTC簇以暴露免疫脆弱性**
CTC簇提供第二个治疗靶点。簇解离可能降低转移效率并增加单个细胞暴露于免疫杀伤。临床前工作将强心苷与CTC簇破坏联系起来，近期概念验证试验显示地高辛可减少转移性乳腺癌中的CTC簇大小。实际下一步不是声称簇解离是确立的抗转移疗法，而是测试簇减少是否改变免疫易感性和临床结局。此类研究应同时测量物理簇破坏和下游免疫识别，因为单独簇大小可能不捕获相关生物学效应。
**组合策略：ICIs + 抗CTC免疫保护机制**
组合策略应围绕匹配的脆弱性构建，而非通用“更多免疫治疗”逻辑。例如，PD-L1阳性和CD47阳性CTCs支持测试适应性加固有检查点阻断，而血小板 coating 或NET相关CTCs支持将ICIs与保护盾破坏方法结合。目前，大多数试验不使用CTC免疫表型作为入组或分层变量。更现实的近期终点是前瞻性验证CTC免疫特征在定义组合方案下预测反应、耐药或转移进展。这将把CTC表型分析从描述性生物标志物转变为匹配免疫逃逸机制与组合方法的试验设计工具。
**挑战、未来方向和临床转化路线图**
临床转化需要可重复测量、可解释的生物学关联以及CTC免疫信息在既定生物标志物之外改善决策的证据。本文献有几个局限性：队列通常较小或回顾性；富集方法、标志物阈值、分母和采样时间不同；机制支持常来自组织或实验模型，而非患者来源CTCs的配对功能研究。这些差异限制跨研究比较以及预测效应与肿瘤负荷或预后的一般关联的分离。此外，本叙述性综合不提供合并效应估计或生物标志物效用的正式定量排名。以下优先事项解决这些局限性。
**核心未解决问题**
代表性是核心生物学限制。CTCs是肿瘤群体的选定且稀有部分，其免疫表型可能不反映原发肿瘤或转移灶。原发肿瘤、转移部位和匹配CTCs的比较研究应确立哪些特征是共享的、哪些是循环相关的、哪些在组织生物标志物之外增加信息。未能检测CTC亚群也必须与真正生物学缺失区分，特别是当富集方法依赖于播散过程中改变的标志物时。
单时间点测试与纵向监测。连续采样是区分CTC分析与组织活检的实际优势，但重复免疫表型分析的时机、频率和解释仍未定义。几个问题未解决：治疗开始后检查点配体表达变化多久可检测；早期治疗中变化是否比基线表型携带更多信息；标志物变化应表示为回收CTCs的比例还是标志物阳性细胞的绝对计数，考虑到治疗期间分子和分母都在移动；以及变化幅度超过检测和生物学变异需要多大。需要在预设采样窗口和足够技术重复以估计测量变异性的前瞻性研究，才能解释个体患者水平的连续表型分析。
通用与疾病特异性标志物面板。核心标志物如PD-L1、MHC-I和CD47可能广泛提供信息，因为它们报告的途径跨癌种运作，但肿瘤谱系、治疗历史和转移部位可能决定哪些免疫特征在给定环境中携带信息。接受PD-1阻断治疗的肿瘤中的相关轴不一定是对抗体-药物偶联物或细胞疗法治疗中的相关轴，且反映固有识别的标志物可能在适应性识别已丢失时更重要。因此，实用策略是共识骨干面板，跨研究以相同方式测量以允许 pooling，结合疾病或治疗特异性附加标志物。这保持可比性而不将生物学上不同的环境强制为单一面板，并允许骨干面板随证据积累而修订，而非过早固定。
**技术推进优先事项**
高维和标准化表型分析平台。将微流控CTC富集与多重抗体成像、成像质谱流式或单细胞蛋白质组学读数整合，可在同一稀有细胞上同时评估20–40个免疫和谱系标志物。此类面板的价值较少取决于标志物数量，而更多取决于可比性：不能在第二实验室复现的30标志物面板对转化的贡献小于具有定义阈值和已知实验室间变异的五标志物面板。因此，优先事项是协调捕获化学、共享染色和成像协议、阳性及其表达分母的通用定义，以及质量控制指标——加标回收、白细胞携带和跨处理延迟的信号稳定性——与每个数据集一起报告。使用共享参考材料的多中心环形研究将是确立给定面板是否可转移的最直接方式。
计算识别和整合建模。AI辅助图像分析可改善稀有CTC亚群检测并减少细胞分类中观察者依赖性变异，这是即使经验丰富读者之间也有记录的分歧来源。超越检测，计算模型应将CTC免疫表型与组织病理学、ctDNA、外泌体标志物、治疗史和临床结局整合，并测试多模态液体活检面板是否优于单分析物方法。此工作适用两项要求。模型必须在独立队列上训练和验证，因为高维CTC数据中候选特征数量远超过大多数研究中的患者数量，过拟合是预期失败模式。模型输出必须保持底层免疫机制水平的可解释性，以产生可测试假设而非不透明风险评分。
新兴体内和连续监测技术。光声流式细胞术、血管内捕获装置和植入式或可穿戴传感概念可能最终将CTC监测扩展到间歇性血液抽取之外。体内方法 interrogate 比标准抽取大得多的血液体积，这解决了CTC分析的核心统计限制之一：在低CTC浓度下，7.5 mL样本可能不含肿瘤细胞，即使循环负荷相当大。当前限制是这些平台大多检测和计数而非表型分析，因此它们尚未提供本综述讨论的免疫标志物信息。它们仍处于早期阶段，但突出了长期方向：从静态快照转向肿瘤-免疫演化的动态监测。
**临床转化推进路线图**
与其他液体活检技术一样，将CTC免疫表型分析从研究检测转变为临床有用测试将需要逐步验证，而非单一确证研究。每个阶段弥合不同差距：显示检测可重复测量预期免疫特征，特征与临床相关结局关联，最后对其采取行动可改善治疗选择、监测或试验设计。以下路线图因此将此进程组织为四个连续阶段（图5），每个阶段具有不同交付物和验证优先事项。
**第一阶段：发现和分析验证。**此阶段目标是在检查任何结局关联之前，显示检测可重复测量预期免疫特征。候选标志物应根据定义的免疫机制和合理治疗轴选择，而非基于抗体可用性。检测性能随后应通过分析灵敏度和特异性、稀有事件检测限以及跨临床遇到的CTC计数范围的加标肿瘤细胞回收来量化。由于CTC免疫读数受分析前处理强烈影响，采血管、处理延迟、固定和富集化学应固定并作为检测定义的一部分报告，而非视为实验室偏好。此阶段优先需求包括参考材料（如特征化细胞系以定义浓度加标到正常血液中）、标准化报告模板、实验室间重复性研究和阳性性的明确定义，指定强度阈值和分母——每细胞、每CTC阳性患者或每毫升血液——针对其表达阳性。
**第二阶段：临床验证。**一旦分析性能确立，问题变为所测量表型是否追踪临床有意义结局。来自已完成免疫治疗试验的存档样本回顾性分析提供初始信号的最快途径，因为治疗、时机和终点已标准化，但受样本可用性、存储相关标志物降解和库藏队列固有选择限制。因此，具有预设采样窗口的前瞻性观察研究需要确认任何回顾性关联。分析应区分预后关联（描述结局无论治疗如何）与预测关联（需要生物标志物与所接受治疗之间的相互作用，因此需要比较组）。终点应在贡献中心间协调，效应估计应针对CTC负荷、疾病环境和治疗线数调整，以使明显的免疫表型效应不仅仅是肿瘤负荷的重述。优先需求包括良好注释队列的可及性、预设统计分析计划和锁定检测的多中心验证。
**第三阶段：临床效用证明。**临床有效性并不确立测量生物标志物有助于患者。证明效用需要比较，其中CTC免疫读数改变管理：随机生物标志物策略设计、将入组限制为定义CTC免疫表型的富集设计，或嵌入常规护理的务实研究。决策规则必须提前固定——哪种表型触发哪种行动，在哪个时间点——因为在结局已知后推导的规则无法在同一数据集中评估。这些研究还应量化CTC读数相对于组织生物标志物、ctDNA、影像学和临床因素已有信息的增量贡献，因为仅与现有测试相关的标志物增加成本而不增加决策。优先需求包括预定义决策规则、增量价值的正式评估、成本效益分析以及与既定组织和液体活检检测的头对头比较。
**第四阶段：实施和监管采用。**如果临床效用被证明，剩余障碍是操作性的而非科学性的。部署需要对其锁定配置的检测进行监管审查、能够支持稀有事件测试的实验室质量体系、报销途径以及与治疗决策兼容的周转时间——在下一周期开始后到达的结果无法影响护理。报告格式必须传达不仅是标志物调用，还有分母、评估的CTC数量以及当很少或没有CTC回收时解释的限制，以便阴性结果不被解读为低免疫逃逸负担的证据。优先需求包括检测认证、外部质量评估计划、临床医生解释教育、周转时间基准和为指南考虑构建的证据包。
**在精准免疫治疗中测试CTC免疫表型分析的概念框架**
图5中的采样框架将基线、治疗中和进展测量与研究问题联系起来。每种用途需要预定义检测、采样计划、终点和分析计划，CTC发现与组织PD-L1、TMB/MSI（如相关）、ctDNA和临床背景一起评估。以下示例是前瞻性研究的假设；它们不指定何时开始、继续、升级或切换治疗。
在基线，研究可测试PD-L1表达与抗原呈递状态一起是否定义在既定生物标志物之外增加信息的可重复CTC亚组。PD-L1阳性、MHC-I完整表型本身并不证明ICI敏感性。低MHC-I为检查NK细胞易感性提供理由，但功能研究还必须评估抑制性配体、激活信号和效应细胞能力。CD47表达可类似地激发吞噬检测和探索性分层。标志物阴性结果可能反映有限检测覆盖或细胞回收，不应解释为低免疫逃逸负担或良好预后。
在治疗期间，前瞻性研究可测试绝对CTC计数、表达PD-L1的比例及其他预设免疫特征的变化是否与后续反应或进展相关。解释明显标志物变化时应考虑总细胞回收和采样变异性。下降、持续或新检测到的免疫标志物阳性CTCs是与影像学和临床结局比较的研究观察，而非继续或升级治疗的独立理由。新检测到的CD47或B7-H3表达可在研究方案内 warrant 机制调查。
在进展时，配对样本可测试抗原呈递、CD47表达、其他检查点途径或聚集的变化是否伴随获得性耐药。这些关联需要根据情况通过匹配组织、互补血液测量或功能检测确认。例如，簇富集可激发同时评估簇破坏和免疫易感性的实验。此类研究可为试验假设提供信息，但单独新检测的CTC特征不能确立耐药原因或选择下一治疗。
**结论**
CTC免疫表型分析通过检查循环细胞如何与免疫监视相互作用扩展了计数。连续采样可识别检查点表达、抗原呈递分子和细胞相关保护特征的变化，但这些变化的解释取决于肿瘤类型、治疗和检测回收。按播散阶段组织证据有助于区分在血液中运作的机制与在原发肿瘤或转移部位研究的机制。
当前证据支持前瞻性研究，而非基于CTC免疫读数的常规免疫治疗选择。PD-L1获得的临床关注最多，而抗原呈递状态、CD47、NK抑制途径和聚集仍为候选生物学或监测变量。涉及CTCs的直接相互作用应与更广泛的肿瘤相关免疫调节区分，后者中CTCs的贡献通常未解决。小队列、检测异质性和对基于模型的机制的依赖限制了跨癌种可得出的结论。
下一步是确立可重复的CTC免疫测量是否在组织生物标志物、ctDNA、总CTC负荷和标准临床评估之外改善预测、监测或试验分层。这需要定义阈值和分母、纵向多中心研究以及临床效用的前瞻性证明。在此条件满足之前，所提出的图表和框架应指导研究问题，而非个体治疗决策。
