Panx1 在循环祖细胞标志物阳性细胞中的表达与衰老及心血管风险的关联：非糖尿病人群中的候选细胞衰老生物标志物研究

《Biomarker Research》：Pannexin 1 expression in circulating progenitor marker-positive cells is associated with senescence and cardiovascular risk

背景：已有研究报道 Pannexin 1（Panx1）在人衰老内皮集落形成细胞（endothelial colony-forming cells，ECFCs）中上调。研究人员检验 Panx1 是否可作为外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中表达祖细胞标志物细胞的衰老潜在生物标志物，及其与炎症、一氧化氮（nitric oxide，NO）和心血管风险的关联。方法：研究人员在 60 名非糖尿病供体（20 名 20–30 岁，40 名 ≥65 岁）的 PBMCs 中检测 Panx1 转录本；在 ECFCs 中检验 Panx1–NO 相互作用；另设 50 名供体（25 名年轻，25 名老年）流式细胞术队列，靶向 CD34+CD45? PBMCs 与 CD133+CD45? PBMCs 中表达激酶插入结构域受体（kinase insert domain receptor，KDR）、Panx1、衰老相关 β-半乳糖苷酶（senescence-associated beta-galactosidase，SA-β-gal）和 NO 的细胞；检测血浆肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）与白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）；Framingham Risk Score（FRS）分析限于老年参与者；采用相关、偏相关、多变量、ROC/AUC 与增量价值分析，并视情况使用错误发现率（false-discovery-rate，FDR）与 bootstrap 程序。结果：老年供体 PBMCs 的 Panx1 转录本高于年轻供体；老年中空腹血糖升高（>100 vs ≤100 mg/dL）和中高危 FRS 者更高；ECFCs 中 Panx1 与 NO 相互作用；老年 PBMCs 中 CD34+CD45? 比例降低、CD133+CD45? 比例升高；每 1×104 细胞中 Panx1+ 细胞增多、NO 相关荧光阳性细胞减少；调整年龄、性别、体重指数和空腹血糖后，Panx1 与 CD34+KDR+CD45? 祖细胞群 SA-β-gal 相关，而其他群体关联被年龄削弱；Panx1 与 NO 无稳健独立关联；合并 Panx1–细胞因子相关主要由年龄组分离解释；老年中 CD34+CD45? 细胞 Panx1 与 FRS 相关（Spearman rs=0.455，名义 p=0.022；FDR p=0.334），可区分 FRS ≥10%（AUC 0.767，95% CI 0.560–0.937），但相对常规临床因素的增量价值未一致确立。结论：选定循环祖细胞群体中的 Panx1 与非糖尿病老年个体的细胞衰老和心血管风险相关；Panx1 作为候选细胞衰老相关生物标志物仍需前瞻性验证。

研究背景方面，循环内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）源于骨髓，表达 CD34、CD133 等祖细胞标志物及 VEGF 受体 2（亦称 kinase insert domain receptor，KDR）等内皮标志物，参与血管修复与血管生成。随年龄增长，EPCs 数量与功能下降，内皮细胞谱系发生衰老，一氧化氮（nitric oxide，NO）生物利用度降低，血管修复能力受损，推动心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）发生。已有研究提示 Pannexin 1（Panx1）在人 CD34⁺ 单核细胞和衍生的内皮集落形成细胞（endothelial colony-forming cells，ECFCs）衰老中上调，并可经 IGF-1 机制调节血管生成、影响内皮 NO 合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）。但 Panx1 能否作为可靠衰老/老化生物标志物仍不清楚。因此，研究人员在非糖尿病真实世界人群中，检验 Panx1 在循环祖细胞标志物阳性细胞中的衰老关联、与 NO 和炎症信号的关系，以及其相对于常规临床因素的心血管风险信息。

本文发表于《Biomarker Research》。研究人员通过两个独立但非验证关系的队列开展研究：一是 60 名非糖尿病供体的 PBMCs 转录本发现队列，二是 50 名供体的流式表型队列；结论为选定循环祖细胞群体中 Panx1 与细胞衰老和心血管风险相关，但是候选而非已验证预测标志物，需前瞻验证。

主要关键技术方法上，研究人员使用两个非糖尿病人群队列：60 名供体用于 PBMCs 中 Panx1 mRNA 检测，50 名供体用于流式细胞术表型分析；以实时 RT-PCR 检测 PBMCs 的 Panx1 转录本；以多色流式细胞术检测 CD34⁺CD45^?、CD133⁺CD45^? 及其 KDR⁺ 亚群中 Panx1、SA-β-gal 与 NO 相关荧光；以 ELISA 检测血浆 TNF-α 与 IL-6；以 2008 版 FRS 评估老年参与者心血管风险；统计上采用 Spearman 相关、偏相关、多变量回归、ROC/AUC、净重新分类改善（net reclassification improvement，NRI）与综合判别改善（integrated discrimination improvement，IDI），并进行 FDR 与 bootstrap 校正。

研究结果部分，Panx1 mRNA expression in PBMCs and cardiovascular risk：研究人员通过实时 RT-PCR 发现老年 PBMCs 的 Panx1 mRNA 高于年轻组；老年中空腹血糖 >100 mg/dL 者高于 ≤100 mg/dL 者，中危和高危 FRS 老年者高于低危者，但与高脂血症、高血压无显著差异；说明 PBMCs 中 Panx1 mRNA 与老化、老年血糖状态和心血管风险有关。

Distribution of CD cell surface markers in PBMCs：研究人员通过流式分析发现，老年相比年轻者 CD34⁺CD45^? 与 CD34⁺KDR⁺CD45^? 细胞减少，CD133⁺CD45^? 与 CD133⁺KDR⁺CD45^? 细胞增多，CD34⁺CD133⁺KDR⁺CD45^? 无显著变化；说明老化伴随特定祖细胞亚群分布改变。

Evaluation of Panx1 as a marker for senescence in circulating progenitor marker-expressing cells：研究人员以 SA-β-gal 作为衰老标志，发现老年组中 CD34⁺CD45^?、CD133⁺CD45^?、CD34⁺KDR⁺CD45^? 和 CD133⁺KDR⁺CD45^? 中 SA-β-gal⁺、Panx1⁺ 及双阳性细胞多数为升高；说明 Panx1 在选定祖细胞阳性群体中可反映衰老表型。

Adjusted association between Panx1 and cellular senescence：研究人员做相关与调整分析，CD34⁺CD45^? 中 Panx1 与 SA-β-gal 无关联；CD133⁺CD45^? 未调整相关在年龄调整后消失；CD34⁺KDR⁺CD45^? 与 CD133⁺KDR⁺CD45^? 中相关在调整年龄、性别、体重指数和空腹血糖后仍保留；说明 Panx1 与衰老的关联具有区室特异性，而非所有祖细胞标志群体的通用替代关系。

Evaluation of the interaction between NO and Panx1 expression in ECFCs：研究人员在 ECFCs 中通过 Panx1 敲低、过表达及 NO 抑制剂 L-NAME 与 NO 供体 NONOate 处理，发现 Panx1 过表达降低 NO 阳性细胞比例，NO 抑制使 Panx1 上升、NO 供体使 Panx1 下降；说明 Panx1 与 NO 在细胞模型中可相互影响。

Evaluation of Panx1 and NO in circulating progenitor marker-positive cells：研究人员在临床 PBMCs 中发现老年组 CD34⁺CD45^? 与 CD133⁺CD45^? 中 NO⁺ 和 NO⁺Panx1⁺ 细胞少于年轻组，CD34⁺KDR⁺CD45^? 中 NO⁺ 减少；说明真实人群中老化伴随祖细胞 NO 相关荧光下降。

Adjusted association between Panx1 and NO：研究人员做调整相关分析，四个祖细胞群体中 Panx1 与 NO 相关荧光均无稳健显著关联，年龄和临床变量调整后仍不显著；说明临床个体层面 Panx1 与 NO 降低无独立线性关联。

Relationship among Panx1, inflammation and cardiovascular risk in circulating progenitor marker-positive cells：研究人员发现老年组血浆 TNF-α 与 IL-6 高于年轻组；合并队列中 Panx1 与细胞因子的相关多在年龄组调整后消失；老年中 CD34⁺CD45^? 细胞 Panx1⁺ 数与连续 FRS 相关，AUC 0.767 可区分 FRS ≥10%，但 FDR 未显著，且相对常规模型的 ΔAUC、NRI、IDI 结果不一致；说明 Panx1 是有潜力的候选风险相关标志物，但增量价值未确立。

讨论部分总结为，本研究回答三个问题：Panx1 是否独立于实足年龄追踪细胞衰老；是否独立关联 NO 或炎症；是否提供超出常规临床因素的心血管风险信息。研究发现 Panx1 与 SA-β-gal 的稳健关联限于 KDR⁺ 祖细胞亚群，不支持将其作为 SA-β-gal 的通用替代；NO 与细胞因子相关多被年龄组结构解释；FRS 关联与中等判别力存在，但增量价值不稳定。研究局限包括非糖尿病台湾人群、单中心、小样本、横断面、无外部验证、两年龄层设计可能放大合并相关。总体而言，Panx1 是可代表选定循环祖细胞衰老表型并关联心血管风险的候选生物标志物，但非已验证预测物。

结论部分翻译为：Panx1 表达随老化增加，并在调整年龄与相关临床协变量后，与选定循环 CD34⁺KDR⁺CD45^? 祖细胞群体中的 SA-β-gal 表达相关。在老年参与者中，CD34⁺CD45^? 群体内的 Panx1⁺ 细胞数与 Framingham 心血管风险相关，并对 FRS ≥10% 显示中等判别力；但其是否提供超出常规临床因素的增量价值仍不确定。调整分析不支持 Panx1 与 NO 相关荧光或系统性炎症标志物的独立关联。因此，Panx1 可代表一种与心血管风险相关的候选细胞衰老关联标志物，值得进一步前瞻性验证。