《Advanced Biotechnology》：A single-cell profile of the porcine immune repertoire: concurrent profiling of T cell receptor and B cell receptor V(D)J sequences in health
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适应性免疫多样性由T细胞受体（T cell receptor，TCR）和B细胞受体（B cell receptor，BCR）组库在不同组织间的复杂组织方式所塑造。然而，健康猪中系统性的跨组织免疫组库分析仍属空白。本研究选取3头14日龄杜洛克×长白×约克夏（Du
适应性免疫多样性由T细胞受体（T cell receptor，TCR）和B细胞受体（B cell receptor，BCR）组库在不同组织间的复杂组织方式所塑造。然而，健康猪中系统性的跨组织免疫组库分析仍属空白。本研究选取3头14日龄杜洛克×长白×约克夏（Duroc×Landrace×Yorkshire，DLY）三元杂交仔猪，均为雄性。经样本纯化后，共保留71，731个细胞。研究人员基于DLY三元杂交仔猪，采用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）联合V(D)J测序，建立了整合配对BCR与TCR组库、覆盖11个免疫相关组织的单细胞图谱。研究鉴定出多样的免疫细胞群体，并揭示淋巴器官、黏膜器官及循环器官中显著的组织特异性异质性。免疫组库分析显示V(D)J基因使用存在偏倚、互补决定区3（complementarity-determining region 3，CDR3）长度分布保守、受体配对具有偏好性，并呈现广泛的克隆型多样性。跨组织分析进一步揭示了协调的克隆型共享模式及免疫细胞亚群间 distinct 的克隆扩增特征。此外，利用研究人员设计的猪特异性V(D)J引物，测序结果在免疫球蛋白等位基因检出方面较既往研究取得适度提升，有望为相关研究提供更可靠的技术方案。综上，本研究为健康DLY三元杂交仔猪适应性免疫系统提供了全面的参考图谱，并为未来猪免疫学、传染病及疫苗应答研究提供了宝贵资源。
研究背景方面，适应性免疫依赖于T细胞受体（TCR）与B细胞受体（BCR）的巨大多样性，这种多样性通过基因片段选择、组合多样性、连接多样性和重轻链配对产生。免疫组库的组成与分布与免疫发育、组织微环境、抗原暴露及疾病状态密切相关，因此系统表征TCR和BCR组库对理解免疫监视、淋巴细胞分化和组织特异性免疫调控至关重要。猪作为全球最具经济价值的家畜之一，持续面临多种传染病威胁，而三元杂交猪是中国农村最常见的养殖品种之一，同样受到病原威胁并造成重大经济损失。然而，以往猪免疫组库研究主要依赖批量测序，分辨率有限，无法将受体特征与免疫细胞身份、功能状态或组织定位直接关联。尽管高通量组库测序已揭示猪V(D)J基因使用的偏好性和克隆型扩增模式，但缺乏同步转录组信息，且健康猪多组织免疫组库的系统性单细胞分析仍十分匮乏。因此，建立健康猪免疫组库的高分辨率参考图谱，对于理解正常免疫稳态并为疾病、感染和免疫干预研究提供比较框架具有重要意义。
研究人员基于3头14日龄DLY三元杂交仔猪，采集11个免疫相关组织，经混合建库后采用单细胞RNA测序联合配对V(D)J测序，建立了整合BCR与TCR组库的跨组织单细胞图谱。研究鉴定出多种免疫细胞群体，揭示淋巴、黏膜和循环器官中显著的免疫细胞组成差异；系统分析了V(D)J基因使用、CDR3长度分布、受体配对模式及克隆型多样性；通过跨组织克隆型共享分析揭示了免疫循环与组织驻留的平衡；并将免疫组库信息映射至单细胞转录组图谱，阐明克隆扩增状态与细胞分化及免疫球蛋白亚型使用的关系。此外，研究人员设计的猪特异性V(D)J引物较既往数据集实现了更高的检测灵敏度和更广的免疫球蛋白等位基因覆盖。该研究为健康猪适应性免疫系统提供了全面参考资源，对猪免疫学、传染病和疫苗研究具有重要价值。
关键技术方法方面，样本来源于广东温氏大华农生物科技有限公司实验动物中心的3头健康雄性DLY三元杂交仔猪，14日龄，平均体重约4.0 kg，经RT-qPCR检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪丁型冠状病毒（PDCoV）、猪轮状病毒（PoRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和非洲猪瘟病毒（ASFV）均为阴性且未接种疫苗。研究人员采用CelCode?高通量单细胞5'转录组试剂盒进行单细胞捕获，使用猪单细胞TCR扩增试剂盒和猪单细胞BCR扩增试剂盒分别富集TCR和BCR序列，基于Sscrofa11.1参考基因组，利用CelScene?流程进行比对和定量，使用Seurat v4.4.0进行聚类分析，并以scRepertoire v2.2.0整合免疫组库数据与单细胞转录组数据。
研究结果部分，3.1 单细胞RNA测序分析：经质量控制后保留71，731个细胞，鉴定出T细胞、B细胞、NK细胞、浆细胞、单核细胞、中性粒细胞、内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞等主要细胞类型，淋巴组织富集适应性免疫细胞，黏膜和肺相关组织则含有较多结构性和固有免疫细胞成分，揭示组织间免疫细胞分布的显著异质性。3.2 B细胞和T细胞亚群的异质性与组织分布：B细胞重聚类鉴定出初始B细胞、记忆B细胞、生发中心B亚群、浆细胞和增殖浆细胞5个亚群；T细胞重聚类解析出初始CD4 T细胞、活化CD4 T细胞、记忆CD4 T细胞、Treg细胞、初始CD8 T细胞、细胞毒性CD8 T细胞、记忆CD8 T细胞、增殖T细胞和双阳性T细胞9个亚群，各亚群呈现组织特异性富集模式。3.3 BCR和TCR序列的免疫组库特征：共鉴定出3，275个BCR克隆和13，431个TCR克隆，BCR和TCR均表现出偏倚的V(D)J基因使用，如IGHV1S2 * 01、IGHJ5 * 01、TRAV15、TRBV20-2 * 01等高频基因；BCR CDR3长度主要富集于10-12和29-31个氨基酸区间，TCR CDR3长度集中于12-14和26-28个氨基酸区间；BCR呈现显著的V-J配对偏好，如IGHV1S201-IGHJ501组合。3.4 克隆多样性、扩增与跨组织共享：外周血、派氏结和肠淋巴结含有较多独特克隆型，大多数克隆型以低频存在，高扩增克隆型仅占少数；多个优势克隆型广泛分布于多种组织，外周血共享受体种类最多，提示淋巴细胞经血液循环活跃再循环。3.5 克隆映射与克隆型重叠分析：BCR克隆共享主要发生在派氏结、肠淋巴结、回肠黏膜和外周血之间，TCR克隆则表现出更高的组织特异性，共享较少；将组库信息按细胞条形码映射至单细胞图谱后，BCR克隆集中于浆细胞和增殖浆细胞亚群，TCR克隆集中于初始CD4 T细胞、初始CD8 T细胞、Treg和记忆CD4 T细胞亚群。3.6 克隆扩增与免疫球蛋白亚型特征：各B细胞亚群中单克隆型占主导，高扩增克隆型在浆细胞相关亚群中相对丰富；IGHM在各亚群中占比超过50%，浆细胞亚群显著富集IGHA和IGHG编码重链，且IGHG亚类使用多样性在该群体中显著升高；与已发表参考数据集相比，本研究检出的重链V、轻链V和轻链J等位基因类型数量显著更多，表明测序策略实现了更高的分辨率和灵敏度。
讨论部分总结：研究人员指出，健康猪免疫系统在生理条件下仍存在持续的免疫更新和低水平免疫激活。BCR和TCR组库均表现出高度结构化且偏倚的V(D)J基因使用模式，提示猪受体重组遵循偏好性选择而非纯随机组装。BCR较TCR表现出更强的V-J配对偏好和更频繁的跨组织共享，研究人员推测这可能与B细胞常规再循环而T细胞更倾向组织驻留有关，但转录分析未发现趋化因子受体表达的显著差异，提示可能涉及替代机制。跨物种比较显示TCR V/J基因使用在猪和人之间保留部分保守特征，而BCR V/J基因使用更具物种特异性。健康状态下大多数克隆型为单拷贝或低频克隆，高扩增克隆仅占小部分，反映了维持广泛抗原识别潜能的需求。由于样本均在免疫基线条件下采集，观察到的多器官克隆共享更可能反映V(D)J重组的内在偏倚，即某些V/J组合和CDR3长度被重组机制优先产生，而非抗原驱动的克隆扩增。关于克隆型定义，采用V-J-CDR3氨基酸序列定义较CDR3-only定义会使独特克隆型数量略有增加，跨组织和跨细胞类型的克隆型共享程度略有降低，但整体克隆型丰度和分布模式高度一致，表明研究结论对克隆型定义选择具有稳健性。该研究的主要优势在于将单细胞转录组分析与配对TCR/BCR V(D)J测序整合，能够在单细胞分辨率下同时表征免疫细胞身份、功能状态和抗原受体特征，这是传统批量组库测序难以实现的。免疫球蛋白链组成分析还揭示了B细胞亚群间抗体使用的显著异质性，包括IGK和IGL轻链的差异利用以及IGHM、IGHD、IGHA和IGHG亚型的可变分布，反映了健康猪中抗体成熟和类别转换重组的动态调控。IGHG亚类使用的多样性进一步表明猪体液免疫存在额外复杂性。研究结论为：本研究建立了健康DLY三元杂交仔猪跨组织单细胞免疫组库图谱，系统解析了免疫细胞异质性、V(D)J基因使用偏倚、CDR3长度保守分布、受体配对偏好、克隆型多样性及跨组织共享模式，并通过猪特异性V(D)J引物实现了较既往研究更全面的免疫球蛋白等位基因覆盖，为猪免疫学、传染病和疫苗应答研究提供了宝贵资源。
