Bacillus来源多功能羧酸酯酶BhEstB揭示PET中间产物降解的羧酸酯酶蓝图

《Applied Microbiology and Biotechnology》：A versatile Bacillus esterase reveals a carboxylesterase blueprint for PET intermediate degradation

　　

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）及其衍生中间降解产物的生物降解是多学科研究的核心焦点。虽然*Ideonella sakaiensis* PETase（IsPETase）和叶堆肥角质酶（LCC）能高效解聚PET，但许多其他PET活性水解酶对可溶性PET中间产物（如对苯二甲酸双（2-羟乙基）酯（BHET）和单（2-羟乙基）对苯二甲酸酯（MHET））表现出更强的活性。研究人员在此描述了一种来源于*Bacillus halotolerans*的多功能羧酸酯酶（BhEstB）。BhEstB在结构上与*B. subtilis*的BsEstB相关，但与经典PETase及大多数已表征的MHETase（包括IsMHETase）存在差异，而与TfCa等羧酸酯酶聚类更近。BhEstB对pNP-酯类表现出广泛的酯酶活性，在pH 8和20–30 °C下活性最高。尽管其对本体聚合物表现出适度的总体活性，但在转化BHET和MHET方面，BhEstB显著优于工程化变体LCC^ICCG和近期发表的古菌阿魏酸酯酶PET46。BhEstB对BHET和MHET表现出极高的活性，在30 °C下1小时内可实现50 mM BHET的完全转化（k_cat = 15.57 ± 1.25 s?1，K_m = 6.54 ± 1.01 mM，催化效率为2.38 × 103 M?1 s?1），并在24小时内将39.8 mM MHET高效转化为对苯二甲酸（TPA）（转化率77%（±0.7%））。这些结果将BhEstB鉴定为目前表征的最有效BHET水解酶之一。综上，这些发现确立了BhEstB是一种多功能的BHET/MHET活性*Bacillus*羧酸酯酶，对商业半结晶PET粉末具有适度活性，为PET中间产物降解酶的多样性扩展做出了贡献。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种广泛应用的芳香族聚酯，因其轻质、耐用和防水特性在商品塑料领域占据重要地位。PET水解酶（“PETase”）在酶促解聚和闭环回收中具有潜在应用价值，成为学术和工业生物技术的关注热点。目前已有超过300种PET降解酶被筛选或表征（见Plastics-Active Enzymes Database, PAZy）。其中，叶堆角质酶（LCC）和*Ideonella sakaiensis* PETase（IsPETase）是最具代表性的模型系统。通过理性设计和定向进化获得的工程变体LCC^ICCG已实现工业规模的PET解聚，支持闭环循环经济。然而，这些高效工程生物催化剂在工业条件下解聚本体PET时，其动力学效率受中间降解产物积累的严重限制。单（2-羟乙基）对苯二甲酸酯（MHET）作为内切型PET水解酶的强效竞争性抑制剂，需依赖多酶组合或两步生物反应体系。专门的MHETase因其特殊的盖状结构域（lid domain）而对单体中间产物具有高度底物特异性，但缺乏对聚合态PET的活性。除中温IsMHETase外，多数已表征MHETase对MHET的亲和力与催化效率均较低，且IsMHETase的工程改造因其复杂结构、表达可溶性限制及机制理解不足而面临困难。因此，提升MHETase活性对于工业级PET高效降解至关重要。Bacillota门包含18种PAZy索引的推定PET酯酶，其与Pseudomonadota和Actinomycetota特征化簇的氨基酸序列相似性较低。其中，*Bacillus subtilis*来源的酯酶BsEst对双（2-羟乙基）对苯二甲酸酯（BHET）表现出显著高活性，其工程形式ΔBsEst的催化效率（k_cat/K_M）提升3.5倍，在30 °C、5 mM底物条件下3小时实现100% BHET转化。基于此，研究人员探究其他*Bacillus*来源酶是否具有类似特性，以及该属酶是否普遍作为多底物“全能型”发挥功能。为此，研究人员挖掘了一株新分离的耐盐*Bacillus*菌株（HGR5）基因组，鉴定了一种对聚合物及其中间产物均具活性的酯酶。

**研究内容与主要结论**
研究人员报道了来源*Bacillus halotolerans*的多功能酯酶BhEstB（GenBank编号：PZ568891）的生化表征。结构上，BhEstB是一种高度保守的对硝基苄基酯酶，携带盖状结构域。纯化的重组酶对BHET表现出优异催化效率：在30 °C下1小时内完全转化50 mM BHET（k_cat = 15.57 ± 1.25 s?1，K_m = 6.54 ± 1.01 mM，催化效率2.38 × 103 M?1 s?1），并在24小时内将39.8 mM MHET高效转化为对苯二甲酸（TPA）（转化率77% ± 0.7%）。此外，BhEstB在高温下可水解半结晶PET粉末中的可及酯键（产生高达689.5 μM可溶性产物）。这些发现将BhEstB确立为当前最有效的BHET水解酶之一，同时为Bacillota羧酸酯酶在PET中间产物水解方面的机理提供关键生化见解。

**关键技术与方法**
研究人员采用隐马尔可夫模型（HMM）搜索B. halotolerans HGR5基因组，鉴定出19个推定PETase开放阅读框，选择得分最高的BhEstB（1461 bp，编码486个氨基酸，预测分子量54 kDa）进一步研究。系统发育分析采用最大似然法（500次bootstrap重复）。三维结构预测及结构比较利用AlphaFold2、Dali服务器及USCF ChimeraX。底物结合口袋预测通过Protein+与ConSurf服务器，分子对接采用Attracting Cavities 2.0引擎。基因克隆在pET21a(+)载体中，于*E. coli* BL21(DE3)中异源表达，经Ni-NTA亲和纯化获得约98%纯度的重组蛋白。生化表征采用对硝基苯基（pNP）酯（C4–C18）测定底物偏好、温度（4–70 °C）和pH（4–11）优化。BHET降解动力学通过常规和逆Michaelis–Menten方程获取。PET降解实验采用无定形PET薄膜（33.6 μmol TPA当量）和半结晶PET粉末（9.6 μmol TPA当量），在30–70 °C和450 rpm振荡下孵育24小时。降解产物通过RP-UHPLC定量。蛋白热稳定性使用NanoDSF分析（20–95 °C）。中心复合设计（CCD）与响应面法（RSM）用于优化PET降解，人工神经网络（ANN）耦合遗传算法（GA）进行非线性建模与优化。绝对误差按公式1计算。

**主要研究结果**
**隐马尔可夫模型搜索揭示BhEstB为候选PET水解酶**：基于HMM搜索从B. halotolerans HGR5基因组鉴定出得分最高的ORF BhEstB，与B. subtilis的BsEstB序列一致性最高（83%），与B. safensis来源LipMRD9同源性为74%。BhEstB无分泌信号肽，提示其天然功能位于胞内。序列比对显示该酶在细菌中广泛分布，且不依赖于塑料污染环境。

**独特结构特征将BhEstB与其他细菌对应物区分开**：保守结构域搜索显示BhEstB含经典羧酸酯酶/脂肪酶结构域，系统发育分析表明其与BsEstB聚类，属于系统发育上分化的PETase。与BsEstB比较显示活性位点具有相同基序和氨基酸组成。Dali结构比对显示其与BsEstB高度相似，与TfCa共享保守羧酸酯酶折叠（RMSD = 0.887 ?），但无PET46、MHT077和IsMHETase的序列相似性。鉴定出TfCa型盖状结构域，但未发现IsMHETase的大型盖状结构域或PET46/MHT077的短盖状结构域。分子对接显示BHET、MHET和3PET以最低结合能（?7.2516、?6.4935和?10.3185 kcal/mol）的取向结合在活性位点附近。

**BhEstB在中温下水解pNP酯和BHET**：纯化重组BhEstB产量高（40–60 mg/L），纯度约98%。对长链pNP酯（C16–C18）无活性，符合酯酶分类。pH 8下活性最高，温度范围4–50 °C内最大活性出现于20–30 °C，高于60 °C迅速下降。NanoDSF分析显示两个热转变值（51.2 °C和62.3 °C），符合多步解折叠过程。60分钟孵育后，40 °C保留全活性，51 °C损失25%，56 °C以上5分钟内丧失90%以上活性。

**BhEstB对3PET和BHET/MHET降解活性**：在30 °C下24小时降解超过98%的3PET（线性三聚体），60 °C下显著失活。在30 °C、50 mM BHET条件下，BhEstB在1小时内完全降解并在24小时内转化39.8 mM MHET为TPA。4 °C仍能6小时完全降解BHET，但MHETase活性显著下降；60 °C时与对照无差异。IsMHETase无BHETase活性，而LCC^ICCG和PET46分别在3小时和12小时降解50 mM BHET，但MHETase活性有限（67%和10%）。

**BhEstB在PET降解级联中高效降解MHET**：以LCC^ICCG水解PET粉末4小时富集MHET作为底物，BhEstB在30 °C、20小时内降解73% ± 4%的MHET（10 mM初始浓度）。除IsMHETase外，BhEstB优于所有测试酶。IsMHETase在4小时内达到100%转化，而LCC^ICCG和PET46仅在68 °C下表现明显活性。

**BhEstB高效水解BHET的动力学分析**：常规动力学测定得K_m = 6.54 ± 1.01 mM，k_cat = 15.57 ± 1.25 s?1。逆动力学实验显示k_inv = 0.1 ± 0.02 mM，提示不溶性底物界面催化模型。在1和4小时数据对比中，酶浓度低时未观察到显著差异，提示可能存在酶失活影响。达到0.16 μM浓度即可在1小时内降解4 mM BHET，而MHET降解需要0.64 μM和4小时。

**BhEstB在高温下对PET粉末有活性**：在24小时间对半结晶PET粉末降解实验中，BhEstB在60 °C产生689.50 μM芳香产物（TPA+MHET+BHET），70 °C产生556.37 μM。低温和对照条件下无活性。对PET薄膜无检测活性。

**建模验证生化特性并优化降解条件**：CCD/RSM模型显示F值15.02，P值0.000，模型显著，但lack-of-fit的P值为0.000提示拟合不佳。三维表面图显示最高活性出现在最高酶浓度、pH>8和温度>65 °C区域。ANN耦合GA优化预测最大释放产物为1286 μM，实际实验值1260 μM，绝对误差仅2%，验证了模型的准确性。

**讨论与结论**
讨论部分指出，HMM序列比对能发现传统同源搜索难以识别的多样化PETase。BhEstB的最近同源物BsEstB虽在60 °C保留70%活性，但未评估粉末降解活性。BhEstB和TfCa等羧酸酯酶对BHET活性高于对MHET，但仍具有可观MHETase活性。BhEstB的来源菌株B. halotolerans在塑料污染前已存在于环境中，其活性可能与天然芳香酯类代谢，或卤代β-内酰胺抗生素的水解有关。BhEstB在60–70 °C仍能降解PET粉末，但热稳定性差，提示可能是早期短暂高温暴露下水解了易于可及的表面非晶区或寡聚物。ANN建模优于RSM，较好映射了参数影响。总体而言，BhEstB作为*Bacillus*属多用途BHET/MHET活性酶，在高温下展现出PET粉末降解能力，尽管不适用于直接PET解聚，但其高效转化高浓度BHET和MHET的特性，为解决LCC^ICCG等工业酶中间产物抑制问题提供辅助策略，可用于多酶级联反应以提升工业PET回收效率。研究结论：BhEstB是一种多功能、高效的BHET/MHET降解酶，对半结晶PET粉末具有适度活性，是与LCC和IsPETase等经典PETase在序列和结构上均显著分化的新型PET中间产物降解酶。