ANGPTL8通过受体PirB抑制PI3K/AKT信号通路诱导造血干/祖细胞衰老

《Biogerontology》：ANGPTL8 induces the aging of hematopoietic stem/progenitor cells

　　

造血作用依赖于造血干/祖细胞（HSPCs）的持续功能。然而，衰老会逐步损害HSPC的功能，导致免疫衰老、血液系统恶性肿瘤和退行性疾病。因此，阐明HSPC衰老的机制对于制定缓解年龄相关功能障碍的策略至关重要。在此，研究人员发现血管生成素样蛋白8（ANGPTL8）（一种已知在葡萄糖和脂质代谢中起作用的分泌型糖蛋白）是HSPC衰老的新型调控因子。系统性敲除ANGPTL8显著减轻了多种小鼠组织中与衰老相关的表型。体外和体内对增殖能力、集落形成能力、线粒体膜电位、衰老相关分泌表型（SASP）表达、活性氧（ROS）积累、髓系偏倚以及早期造血再生的分析进一步证明ANGPTL8促进HSPC衰老。机制上，ANGPTL8缺失激活了PI3K/AKT信号通路，而PI3K激活剂可挽救重组ANGPTL8（rANGPTL8）诱导的衰老效应。此外，免疫共沉淀（Co-IP）证实rANGPTL8直接与跨膜受体PirB相互作用。重组PirB（rPirB）降低了PI3K/AKT的磷酸化水平，而敲低PirB则有效阻断了rANGPTL8对PI3K/AKT磷酸化的抑制作用。总之，研究人员的发现表明，ANGPTL8主要通过其受体PirB抑制PI3K/AKT通路来驱动HSPC衰老，这为缓解HSPC衰老提供了新的潜在靶点。

一、研究背景

造血干/祖细胞（HSPCs）的持续功能是维持整个生命周期造血的关键。然而，衰老会逐步损害HSPC的功能，不仅导致免疫衰老，还增加了血液系统恶性肿瘤和退行性疾病的发病风险。尽管已有研究揭示了HSPC衰老的一些特征，如再生潜能受损、向髓系分化偏移等，但其背后的分子机制尚不完全清楚。血管生成素样蛋白8（ANGPTL8）是一种主要由肝脏和脂肪组织分泌的糖蛋白，已知参与葡萄糖和脂质代谢的调节。近期研究表明ANGPTL8与多种退行性疾病相关，且研究人员在前期研究中意外发现，ANGPTL8基因敲除（KO）小鼠的肝脏转录组中大量与造血分化相关的基因表达发生改变。基于此，本研究旨在探索ANGPTL8是否参与并如何调控HSPC的衰老过程，为开发延缓造血系统衰老的新策略提供理论基础。

二、研究目的与结论

研究人员通过系统性ANGPTL8基因敲除小鼠模型以及体外重组蛋白处理实验，全面评估了ANGPTL8对HSPC衰老的影响。研究得出结论：ANGPTL8是一个新型的HSPC衰老促进因子。它通过与其受体PirB结合，抑制PI3K/AKT信号通路的活性，从而上调衰老标志物表达、增加活性氧（ROS）水平、诱导线粒体功能障碍、加剧髓系分化偏倚，并损害HSPC的再生潜能。该发现揭示了ANGPTL8在造血系统衰老中的新角色，为通过靶向ANGPTL8或其下游通路来干预造血衰老提供了潜在的分子靶点。

三、主要技术方法

1. 1.
   动物模型：利用CRISPR/Cas9技术构建全身性ANGPTL8基因敲除（ANGPTL8^-/-）C57BL/6J小鼠，并以野生型（WT）同窝小鼠为对照。小鼠分别饲喂正常饮食（NCD）或高脂饮食（HFD）10个月或20个月，模拟不同衰老阶段。
2. 2.
   细胞分选与体外处理：采用免疫磁珠阳性分选法从骨髓中分离c-Kit⁺ HSPCs。体外实验中，使用重组ANGPTL8蛋白（rANGPTL8）、PI3K激活剂YS-49、重组PirB蛋白（rPirB）或PirB小干扰RNA（siRNA）处理HSPCs。
3. 3.
   表型与功能分析：运用流式细胞术分析HSPC亚群比例、细胞周期、ROS含量、线粒体膜电位及髓系/淋系分化；通过β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老；使用甲基纤维素半固体培养基进行集落形成实验；建立骨髓移植模型评估HSPC的早期造血再生能力。
4. 4.
   分子机制探究：对WT和ANGPTL8 KO小鼠的c-Kit⁺ HSPCs进行RNA测序（RNA-seq）以筛选差异表达基因和富集信号通路。采用蛋白质印迹法（Western blot）检测衰老标志物（P53、P21、P16）及PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的表达和磷酸化水平。通过免疫共沉淀（Co-IP）验证ANGPTL8与受体PirB的直接结合。

四、研究结果

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  ANGPTL8基因敲除下调部分组织的衰老表型：与WT小鼠相比，ANGPTL8 KO小鼠在NCD喂养20个月后，肝、肺、脾等组织中衰老标志物P53、P21、P16及衰老相关分泌表型（SASP）因子的mRNA和蛋白表达水平均显著降低。水迷宫实验显示KO小鼠的学习记忆能力更强，Micro-CT检测也表明其骨密度更高。在高脂饮食喂养下，KO小鼠的生存率显著高于WT小鼠。
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  ANGPTL8基因敲除下调体内HSPC的衰老表型：流式细胞术分析显示，在多种饮食条件下，ANGPTL8 KO小鼠骨髓中长程造血干细胞（LT-HSCs）的比例显著高于WT小鼠。其c-Kit⁺ HSPCs中衰老标志物、细胞极性蛋白Cdc42和DNA损伤蛋白γ-H2AX的表达更低，同时线粒体ROS含量和线粒体膜电位去极化程度也更低。
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  重组ANGPTL8蛋白体外上调HSPC的衰老表型：用rANGPTL8蛋白处理c-Kit⁺ HSPCs后，β-半乳糖苷酶阳性细胞比例显著增加，增殖标志物Ki67表达下降，而P53、P21、P16及SASP因子的表达显著上升。
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  ANGPTL8促进髓系偏倚的造血：在NCD-20M的WT小鼠中，骨髓内常见髓系祖细胞（CMPs）比例升高而淋巴系祖细胞（CLPs）比例降低，而ANGPTL8 KO则逆转了这一趋势。KO小鼠骨髓和血液中髓系细胞（CD11b⁺、CD14⁺）比例降低，淋巴系细胞（B220⁺、CD19⁺、CD3⁺）比例升高。体外集落形成实验也表明，来自KO小鼠的HSPC向髓系克隆分化的能力减弱。
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  ANGPTL8影响HSPC的早期造血再生：将ANGPTL8 KO小鼠的骨髓细胞移植到经致死剂量辐照的受体鼠后，受体鼠骨髓和脾脏中供体来源的造血细胞、LSK HSPCs及各系血细胞的比例均高于接受WT骨髓细胞的受体鼠。反之，经rANGPTL8预处理的HSPC在移植后的再生能力则显著受损。
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  ANGPTL8通过PI3K/AKT通路上调HSPC衰老表型：RNA-seq分析发现ANGPTL8 KO显著上调了HSPCs中PI3K/AKT通路相关基因的表达。Western blot验证显示KO小鼠HSPCs中p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的水平升高，而rANGPTL8处理则降低这些蛋白的磷酸化。PI3K激活剂YS-49可以逆转rANGPTL8诱导的衰老标志物上调、β-半乳糖苷酶活性增强和髓系分化偏倚。
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  ANGPTL8通过受体PirB作用于PI3K/AKT通路：研究发现，HSPCs表达PirB受体，且rANGPTL8处理能上调其表达。Co-IP实验证实了ANGPTL8与PirB的直接结合。使用重组PirB蛋白（rPirB）可抑制PI3K/AKT磷酸化，而敲低PirB（siPirB）则能阻断rANGPTL8对PI3K/AKT磷酸化的抑制作用。

五、讨论与结论

研究人员在讨论中指出，本研究首次揭示了ANGPTL8作为HSPC衰老的新型调控因子。ANGPTL8通过结合其受体PirB，抑制PI3K/AKT信号通路，进而促进衰老标志物和SASP因子的表达，诱导线粒体功能障碍和ROS积累，最终导致HSPC自我更新和再生能力下降，并加剧髓系分化偏倚。研究还强调了热量限制可能通过降低ANGPTL8的分泌来发挥抗造血衰老的作用。研究结论为：ANGPTL8主要通过其受体PirB抑制PI3K/AKT通路来驱动HSPC衰老，这为缓解HSPC衰老提供了新的潜在靶点。