法国阿尔卑斯与格陵兰受人类影响雪环境中可培养细菌致病相关表型与全基因组特征评估

《Extremophiles》：Assessment of pathogenic traits in selected bacteria isolated from snowy environments in France and Greenland

　　

近几十年来，由于冷环境微生物具有使其在极端条件下存活的独特适应机制，其受到越来越多关注。越来越多的证据表明，某些冷适应细菌（cold-adapted bacteria）具有与致病性（pathogenicity）相关的表型（phenotypic）和基因组（genomic）特征，这引发了对它们潜在环境与公共卫生（public health）相关性的担忧。在本研究中，研究人员对从法国阿尔卑斯山（Chamrousse）和格陵兰沿海（Nuuk）受人类影响雪环境中分离的三株可培养细菌（culturable bacteria）进行了表征。雪样在R2A培养基（R2A medium）上培养，分离株通过Sanger测序（Sanger sequencing）鉴定为 Peribacillus、Sphingomonas 和 Subtercola。通过基于培养的试验（culture-based assays）评估温度耐受性（temperature tolerance）、溶血活性（haemolytic activity）和抗生素敏感性（antibiotic susceptibility），同时使用全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）并借助参考数据库（reference databases）筛选抗生素耐药（antibiotic resistance）和毒力相关基因（virulence-associated genes）。仅 Peribacillus 分离株耐受37 °C并显示α-溶血（α-haemolysis）。抗生素敏感性试验（antibiotic susceptibility testing）表明 Peribacillus 完全敏感，而 Sphingomonas 和 Subtercola 对有限数量的抗生素表现出敏感性降低，主要对头孢噻肟（cefotaxime）、氯霉素（chloramphenicol）和黏菌素（colistin）。基因组编码与外排（efflux）、靶点修饰（target modification）、运动/黏附（motility/adhesion）和应激适应（stress adaptation）相关的基因，表明其具有环境适应力（environmental resilience）而非临床致病性（clinical pathogenicity）。总体而言，这些分离株表现出有限的致病表型（pathogenic phenotypes），其基因组特征主要支持环境适应和生存。

研究背景方面，冷环境如雪包、冰川和极地曾被认为不适合生命，现已知其包含多样且代谢活跃的微生物群落。冷适应细菌（cold-adapted bacteria，指能在低温环境中存活和生长的微生物）具有适应冷冻、低营养和高紫外线等极端条件的机制，许多具有广温耐受能力，可在较宽温度范围内存活，甚至包括与人类或动物宿主相关的温度。这些细菌在冷环境中参与有机物分解、生物地球化学循环和营养周转。除生态作用外，部分冷环境细菌可表达与致病性（pathogenicity，指引起疾病的能力）相关的性状，例如Mogrovejo-Arias等报道从Svalbard冰雪分离的细菌在血琼脂上具有溶血活性。冷冻圈中抗生素耐药（antibiotic resistance，指微生物抵抗抗生素作用的能力）基因的存在也引起关注，这些环境可能作为本征和获得性抗生素耐药的储库。人类相关活动，包括旅游和长距离大气传输，可将耐药细菌与耐药决定子传播到这些栖息地，挑战冷冻圈为原始环境的观念。在极端环境中，包括临床相关抗生素耐药基因已有发现。气候变化和人类活动增加冷环境微生物暴露和选择压力，因此监测这些性状重要。本研究采样两个不同冷栖息地：法国Grenoble的Chamrousse滑雪度假村和格陵兰Nuuk沿海越野滑雪道。二者在大气微生物沉降方面可比，但直接人类影响程度不同；Nuuk雪微生物群落受陆地和海洋来源大气播种及人为源影响，而Chamrousse直接暴露于频繁游客和国际旅游基础设施。研究目的是用表型和分子技术表征从两地获得的三株可培养细菌（culturable bacteria，指可在实验室培养基上形成菌落的细菌），评估温度耐受、溶血活性和抗菌敏感性，并通过全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS，指测定完整基因组序列）和比较生物信息分析寻找抗生素耐药和毒力相关基因（virulence-associated genes，指可能与致病过程相关的基因），以了解其生态行为和潜在健康相关性。

关键技术方法：研究人员于2024年2月从法国Chamrousse滑雪场和格陵兰Nuuk地区采集雪样，每地三个样本。雪样融化后涂布R2A培养基，在不同温度培养并纯化分离株；通过Sanger测序和16S rRNA基因鉴定；温度耐受采用OD₆₀₀与CFU计数，计算生长率、倍增时间或半衰期；溶血活性用绵羊血和马血血琼脂检测；抗生素敏感性用纸片扩散法并参照CLSI；全基因组用Nanopore测序，Flye组装、PROKKA注释、BUSCO评估，结合TYGS、平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）和CheckM进行系统发育与分类分析，并以综合抗生素耐药数据库（Comprehensive Antibiotic Resistance Database, CARD）和毒力因子数据库（Virulence Factor Database, VFDB）筛选耐药与毒力相关基因。

研究结果：
分离株描述：雪样培养获得三株细菌。法国样本在15 °C培养15天后出现两株形态不同菌落：FrY为白黄色、圆形、黏液状、光滑、有光泽；FrO为较小、圆形、黄橙色。格陵兰样本在4 °C培养六周后出现单菌落sn3_GRW，为小、不规则、白奶油色。Sanger测序16S rRNA将三株分别归为Peribacillus（FrY）、Sphingomonas（FrO）和Subtercola（sn3_GRW）。

分类学鉴定：Nanopore全基因组测序补充鉴定。基因组距离和系统发育树显示，FrY与Peribacillus butanolivorans聚在同一基因组群，可能属于该种；FrO和sn3_GRW分别与Sphingomonas faeni和Subtercola lobariae最近，但ANI低于常用95%种阈值，形成独立簇，提示可能为各自属内潜在新种，但需进一步分析确认。CheckM系统发育树与ANI树一致，sn3_GRW形成与Subtercola lobariae分开且支持良好的进化支，bootstrap支持率为100%；FrO和FrY分别与最近参考基因组紧密聚类。

温度耐受试验：在4、15、25和37 °C培养15天，以OD₆₀₀和CFU/mL评估。FrY（Peribacillus sp.）在所有测试温度均生长，温度耐受最广；基于CFU的生长率分析显示所有温度均为正生长，最高区间比生长率在4 °C（μ=0.018 h^?1；倍增时间38.6 h），随后为15、25和37 °C；但最高OD₆₀₀和最终活菌数在15和25 °C，第15天CFU约1.5×10⁸ CFU/mL，37 °C约9.6×10⁶ CFU/mL。FrO（Sphingomonas sp.）在4 °C生长最快（μ=0.024 h^?1；倍增时间28.8 h），15 °C较慢（μ=0.005 h^?1；倍增时间146.4 h），25 °C呈负增长，37 °C无可测生长；CFU最高在4 °C，约2.0×10⁸ CFU/mL（第10天），显示嗜冷特征。sn3_GRW（Subtercola sp.）OD₆₀₀最高在4 °C，但所有温度下生长率为负，表明初始增加后活菌数逐渐下降；最短半衰期在37 °C（11.0 h），其次25 °C（16.3 h），15 °C（62.1 h），4 °C（272.1 h）；CFU最高在4 °C，约9.0×10⁷ CFU/mL（第4天），随温度升高逐渐下降，37 °C仅有限存活。

溶血活性：在绵羊血和马血琼脂上无差异。Peribacillus sp.在15、25和37 °C均显示α-溶血（α-haemolysis，指部分裂解血红蛋白产生绿色或棕色变色），表现为菌落周围培养基棕色变色；25和37 °C在24 h检测到，15 °C延迟至48 h。Sphingomonas sp.和Subtercola sp.在所有测试条件的血琼脂上均不生长。

抗生素敏感性：因许多环境细菌缺乏标准临床折点，研究采用比较方法，以CLSI参考菌株的敏感折点计算平均阈值，仅作比较参考。Peribacillus sp.是唯一在CLSI推荐条件（Mueller-Hinton琼脂，37 °C）下测试的分离株，抑菌圈均较大，无耐药证据。Sphingomonas sp.因嗜冷在15 °C测试，对多数抗生素广泛敏感，ciprofloxacin、amikacin和gentamicin抑制强；但cefotaxime、chloramphenicol和colistin抑菌圈明显较小，低于计算阈值，提示敏感性降低；vancomycin和erythromycin也产生大圈，但这些抗生素通常对革兰阴性菌无效。Subtercola sp.因不能在标准Mueller-Hinton琼脂生长而在R2A培养基测试，对rifampicin、erythromycin、ampicillin、tetracycline、chloramphenicol和vancomycin高度敏感，抑菌圈大；cefotaxime和colistin圈较小，colistin呈边界抑制；ciprofloxacin无抑菌圈，平板均匀生长。由于培养条件不同，直接比较三株菌抑菌圈直径需谨慎。

抗菌药物耐药与毒力相关基因：以BLASTn搜索CARD和VFDB，并手动校正，仅纳入全编码区高核苷酸一致性基因。总体上，未鉴定到经典高风险耐药或毒力决定子。检测到的基因主要与外排介导的多药耐药、靶点修饰、应激适应、荚膜生物合成和运动相关。若干VFDB命中为高度保守的管家蛋白，具有广泛细胞功能，因此应谨慎解释，不能作为致病潜力直接证据。

讨论部分总结：三株来自受人类影响雪环境的细菌致病性相关表型少。虽鉴定到若干抗菌药物耐药相关基因，但在实验条件下未在表型试验中表达。主要基因组和表型特征，包括温度耐受模式，符合在冷和寡营养栖息地生存，提示其特性主要由生态生理适应塑造，而非临床相关致病潜力。冷适应微生物可产生冷活性酶、色素和抗微生物化合物等次生代谢物，作为适应机制；许多毒力和耐药相关基因可能源于与致病性无关的生态功能。分离株属于Subtercola、Sphingomonas和Peribacillus。培养中快速生长丝状真菌在较高温度下常覆盖平板，可能竞争淘汰慢生长细菌；低温培养使这些慢生长细菌得以回收，符合南极环境微生物常需延长低温低营养培养的观察，也显示培养依赖方法只能回收雪环境微生物的一部分。Subtercola常从冷环境包括冰尘、高山植被和冷水栖息地分离；sn3_GRW最近亲Subtercola lobariae原从中国高海拔雪环境分离，支持生态一致性。Sphingomonas见于雪、冰和南极土壤；FrO最近亲Sphingomonas faeni原描述为空气传播、尘埃相关细菌，提示该属可长距离大气传播。Peribacillus见于中温土壤和冷环境如永久冻土；FrY与Peribacillus butanolivorans聚类，该种原从立陶宛土壤描述，提示该谱系具生态灵活性。FrO和sn3_GRW可能为潜在新种，但ANI不足以稳健划分物种，分类地位仍初步。温度方面，预期冷环境来源菌偏好低温，但能在37 °C生长可能与致病潜力有关。OD₆₀₀反映生物量积累，却常高估25和37 °C生长，因浊度稳定但CFU/mL急剧下降，因此评估冷适应或慢生长菌需结合光学和培养测量。Peribacillus分离株广温耐受，15–25 °C活菌最高且37 °C存活，符合该属广温生长报道，孢子形成基因支持其广温耐受。Sphingomonas和Subtercola明显冷适应。Sphingomonas通常耐冷，4–15 °C存活，最适约20 °C；本菌4 °C达峰值，似嗜冷。Subtercola通常归为嗜冷，从冷寡营养栖息地分离；低温慢而持续生长在贫营养环境中有利，可避免资源快速耗尽。致病性方面，Subtercola主要研究冷适应和多糖代谢，基因组富含CAZymes和应激反应基因；Peribacillus近年从Bacillus分出，一般非致病，主要环境研究，但某些菌株有机会性性状，包括生物膜形成和青霉素耐药，罕见临床报告提示多微生物感染中可能协同致病；Sphingomonas为低毒力机会性属，S. paucimobilis最常与易感患者设备相关感染有关。溶血方面，溶血素可通过裂解红细胞释放铁支持致病性，但环境微生物中可能主要服务营养获取和竞争。Peribacillus在绵羊血和马血上均表现α-溶血，不同温度一致，25–37 °C出现更快，可能因生长率更高；两种血反应相同提示非选择性溶血作用。Sphingomonas和Subtercola血琼脂不生长，与寡营养细菌在富培养基生长差一致；其无溶血可能反映生长限制而非无溶血活性，负结果需谨慎解释。抗生素耐药方面，测试11种覆盖主要类别的抗生素，但慢生长菌需方法调整，影响抑菌圈：低温长孵育倾向增大圈，R2A低琼脂浓度增强扩散也增大圈。因此药敏结果仅为相对抑制模式的比较评估，而非确定性临床分类；三株菌抑菌圈直径直接比较也需谨慎。Peribacillus在标准条件下无表型耐药，与临床P. simplex大多敏感的报告一致，环境Bacillaceae耐药谱可变；完全敏感可能反映自然栖息地选择压力低。Sphingomonadaceae耐药谱可变，家族中固有colistin耐药常见；本菌对colistin、cefotaxime和chloramphenicol敏感性降低，符合该组环境菌变异。Subtercola药敏数据少，北极分离株曾报告对多种抗生素敏感性降低；本菌相似，包括cefotaxime降低、colistin边界抑制、ciprofloxacin完全生长，符合革兰阳性菌对多黏菌素固有耐药及氟喹诺酮因外排效果降低。临床意义方面，colistin是多重和碳青霉烯耐药革兰阴性病原最后选择，其耐药增加是全球关注；cefotaxime为第三代头孢菌素，耐药常与ESBL机制相关，限制治疗选择。基因组筛选中，耐药和毒力基因存在即使未表达也相关，因许多毒力基因受温度、pH或离子可用性等环境因素调控。VFDB命中中仅少数如capB、flgL和pgm更直接与宿主互作相关，其余编码基本生理蛋白，虽因 moonlighting 活动被纳入数据库，但应广义解释。Bacillaceae环境分离株ARG常见，多反映本征低水平表达机制而非临床相关耐药；Peribacillus携带类似机制但表型全敏感，符合基因型-表型不匹配。Sphingomonas有多个RND家族外排泵基因（ttgB、oqxB15、acrB），与冷或寡营养环境应激生存一致；重金属暴露可驱动抗生素耐药共选择。Subtercola基因组信息有限，现有研究强调冷适应、氧化应激耐受和次生代谢物产生而非抗生素耐药；本菌携带核心细胞功能和应激反应基因，包括relA，支持在冷寡营养环境营养限制下生存。未研究这些基因的基因组位置，故无法评估其与移动遗传元件关联及水平基因转移潜力，需进一步研究。

研究结论翻译：本研究探索了从雪环境回收的三株细菌分离株的潜在致病性。除提供其表型和基因组特征见解外，研究结果强调需要专门为冷适应环境细菌设计的方法框架。未来工作应建立标准化培养和抗菌药物敏感性测试方案，并改进嗜冷微生物基因组资源，以促进更可靠地解释其生态角色和潜在健康相关性。