没食子酸在鼠肉瘤180（S-180）模型中的抗肿瘤疗效与安全性：抑制增殖、NF-κB信号并激活内源性线粒体凋亡通路

《Medical Oncology》：Antitumor efficacy and safety profile of gallic acid in the murine sarcoma 180 model

没食子酸（gallic acid, GA）是一种植物来源多酚，具有公认的抗癌活性，但体内证据，尤其在间充质实体瘤中，仍然有限。本研究考察了GA在鼠肉瘤180（Sarcoma 180, S-180）模型中的抗肿瘤作用及机制途径。五十只携带S-180肿瘤的雄性Swiss小鼠接受口服GA（10、25或50 mg/kg/天）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU；25 mg/kg，腹腔注射）或溶媒（vehicle），持续七天。评估肿瘤重量和生长抑制，以及组织病理学和免疫组化，检测增殖（Ki-67，一种增殖标志物）、凋亡（裂解型半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）和半胱天冬酶-8（caspase-8）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein, Bax）和B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2, Bcl-2））、核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）及全身毒性标志物（血液学、肝脏和肾脏）。50 mg/kg GA显著降低肿瘤重量和增殖，降低Ki-67和NF-κB表达，增加Bax，降低Bcl-2，并增强裂解型半胱天冬酶-3，表明主要激活内源性（线粒体）凋亡通路。裂解型半胱天冬酶-8水平保持不变。尽管5-FU产生更强的肿瘤抑制，但诱导白细胞减少和脾萎缩，而GA保留血液学、肝脏和肾脏参数。这些发现支持GA作为辅助癌症治疗的有前景候选物。

论文解读
研究背景：癌症仍是全球发病和死亡的主要原因之一。根据全球估计，2020年约有19.3百万新发病例和10百万癌症相关死亡；在巴西，2023–2025三年期间每年预计约704,000新发癌症病例。尽管诊断和治疗取得进展，化疗仍是多数癌症类型的主要治疗策略。然而，基于烷化剂、有丝分裂抑制剂或细胞代谢抑制剂的化疗常伴随治疗反应率差、化疗耐药以及多种不良反应，如脱发、恶心、呕吐、腹泻和免疫抑制。植物来源天然化合物因毒性较低且具有治疗潜力而受到关注。没食子酸（gallic acid, GA）是一种由植物单宁水解获得的天然多酚，具有包括抗癌活性在内的广泛生物效应。体外研究显示，GA对H446（小细胞肺癌）、K562、A549（非小细胞肺癌）、HL60（早幼粒细胞白血病）、MCF-7（乳腺腺癌）以及胶质瘤细胞系U251和U87MG等具有细胞毒作用。GA可调节凋亡、细胞周期阻滞、血管生成、转移、迁移和癌基因表达等关键细胞信号通路。在HeLa细胞中，GA（IC₅₀ = 10.00 ± 0.67 μg/mL）诱导sub-G1细胞周期阻滞，抑制细胞增殖，上调p53和Bax，下调Bcl-2，并激活caspase-8和-9，提示同时激活内源性和外源性凋亡通路。类似地，p53/Bax信号轴激活与GA的细胞毒作用相关，与多柔比星联合时进一步增强。尽管这些研究显著推进了对GA抗癌机制的理解，但它们主要是在体外使用上皮或血液肿瘤细胞系进行。因此，仍存在重要问题：这些分子机制是否能在体内重现，因为肿瘤进展受宿主微环境和全身免疫反应影响。尽管既往研究记录了含GA粗植物提取物的抗肿瘤特性，但口服给予纯化GA对间充质实体瘤的具体作用仍很大程度上未探索。此外，缺乏将其凋亡通路和全身毒性谱与标准化疗进行综合体内比较的研究。因此，本研究旨在评估纯化GA在鼠S-180模型中的剂量依赖性抗肿瘤活性。通过整合表征其作用机制，特别是评估肿瘤细胞增殖、内源性凋亡和NF-κB信号，并详细评估与5-FU相比的血液学、肝脏和肾脏毒性，本研究突出了与既往体外数据的关键机制差异，并建立了关于GA作为辅助抗癌药物的安全性和疗效的新临床前证据。
研究人员开展了以下研究：使用50只雄性Swiss小鼠S-180模型，口服GA 10、25、50 mg/kg/天，5-FU 25 mg/kg腹腔注射，或溶媒，连续7天。结论显示，GA 50 mg/kg显著降低肿瘤重量和增殖，降低Ki-67和NF-κB，增加Bax，降低Bcl-2，增强cleaved caspase-3，而cleaved caspase-8不变，提示主要激活内源性（线粒体）凋亡通路；5-FU抑瘤更强，但诱导白细胞减少和脾萎缩，GA保留血液、肝、肾参数。其意义在于支持GA作为辅助癌症治疗候选物，兼具抗肿瘤活性和较好安全性。
主要关键技术方法：S-180肿瘤来源于巴西Tiradentes大学中央动物设施（UNIT, Aracaju, SE, Brazil），实验室连续体内传代。取S-180腹水细胞，计数后以2×10⁶个细胞/500 μL皮下接种于雄性Swiss小鼠腋窝。50只小鼠随机分五组，接种后24 h开始，每日一次连续7天口服GA或腹腔5-FU，溶媒对照。第8天采血并安乐死，计算肿瘤重量和生长抑制率；肿瘤及肝、肾、脾行H&E组织病理学；免疫组化检测Ki-67、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、Bcl-2、Bax和NF-κB；血液学与AST、ALT、尿素、肌酐等生化检测；采用Shapiro–Wilk、Bartlett/Levene、ANOVA/Tukey或Kruskal–Wallis/Dunn检验，p<0.05为显著。
研究结果：
（1）肿瘤重量与生长抑制：通过肿瘤重量和抑制率评估。GA25和GA50使肿瘤重量分别降至9.38±0.49和7.21±0.42 g/100 g，低于溶媒11.49±0.97 g/100 g；5-FU组4.28±0.33 g/100 g，抑瘤最强，且显著低于GA25和GA50。肿瘤生长抑制率分别为GA25 17.57±4.37%、GA50 33.67±3.75%、5-FU 62.98±2.33%。GA10无显著抗肿瘤效应，肿瘤重量9.65±0.53 g/100 g，抑制率18.18±4.71%。基于活性结果，GA50被选为后续分析剂量。
（2）组织病理学特征：通过H&E评估。各组S-180基线特征相似，呈实体和弥漫性肿瘤增殖，浸润骨骼肌和脂肪组织，神经周围侵犯，广泛凝固性坏死；5-FU和GA50坏死区较小。肿瘤细胞形态异质，主要为多角形、丰富嗜酸性胞质、中央或偏心深染核的横纹肌样细胞；常见上皮样细胞、梭形细胞、少胞质小圆细胞样白血病样细胞和空泡颗粒胞质“植物样细胞”；核分裂活性持续高（>4 mitoses/10 fields，400×）。
（3）免疫组化增殖、凋亡与NF-κB表达：通过免疫组化定量/半定量。Ki67和NF-κB为核表达，cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、Bcl-2和Bax为胞质染色。GA显著降低Ki67至9.5±3.6%（溶媒14.2±2.6%），增加cleaved caspase-3（9.0，2.0–4.0；溶媒3.0，2.0–4.0），增加Bax（8.0，6.0–9.0；溶媒3.0，2.0–6.0），降低Bcl-2（1.0，1.0–4.0；溶媒4.0，4.0–6.0）和NF-κB（14.4±7.9%；溶媒38.4±9.3%）；GA与溶媒cleaved caspase-8无显著差异。提示GA抑制增殖并偏向内源凋亡。
（4）5-FU对照组免疫组化差异：5-FU组所有免疫组化标志物均与溶媒显著不同。与GA比，5-FU组Ki67（7.3±2.8%）和NF-κB（9.9±7.6%）更低，caspase-8（1.0，1.0–2.0）更高。提示5-FU更强抑制增殖和NF-κB并可能涉及外源凋亡。
（5）血液学与生化参数：红细胞指数无显著组间差异。5-FU组总白细胞显著降低（2.07±0.83×10³/mm³），符合骨髓抑制；血小板正常。ALT相似；5-FU组AST显著低于溶媒（97.66±28.33 U/L）。尿素和肌酐在参考范围，肾功能保留。
（6）器官重量与组织学：肝、肾重量组间无显著差异；5-FU组脾重量较GA和溶媒显著降低。组织学肝、肾正常；5-FU组脾白髓萎缩、滤泡直径减小、淋巴组织破坏。
讨论总结：GA有多重抗癌相关生物效应，但体内证据有限，尤其机制。S-180模型植入高效、生长快。肿瘤重量和抑制率是体内抗肿瘤活性关键指标。本研究表明GA在S-180中呈剂量依赖抗肿瘤，首次在该模型评估，与既往异种移植模型一致。机制上，GA降低Ki-67提示抑制增殖，可能通过抑制PI3K/Akt、下调cyclin D1、上调p21和p27及G1/S细胞周期阻滞；但Ki-67降低也可能反映增殖细胞经凋亡被清除。GA增加cleaved caspase-3，增加Bax、降低Bcl-2且cleaved caspase-8不变，支持优先激活内源性（线粒体）凋亡通路，而外源通路可能非主要。GA降低NF-κB，提示抑制肿瘤细胞存活和增殖信号；既往报告GA抑制MAPK/NF-κB，可能通过降低p65磷酸化和改变乙酰化。总体GA抗肿瘤机制互补：抑制增殖、抑制NF-κB、优先内源凋亡。GA疗效低于5-FU，后者Ki-67和NF-κB抑制更强并有caspase-8激活，提示内源和外源通路均参与。血液学上，GA保留白细胞，5-FU致白细胞减少和脾白髓萎缩，反映骨髓抑制；红细胞参数轻微波动视为生理性。肝肾功能完整，血清AST、ALT、尿素、肌酐正常且无组织病理改变；讨论指出GA 50 mg/kg时AST下降可能反映肿瘤生长和相关肌肉损伤减少。总体GA是辅助化疗的有前景候选物，可减轻血液学不良反应并保留肝肾功能。
研究结论翻译：总之，这些发现表明，GA在鼠S-180模型中发挥显著抗肿瘤活性，该活性与肿瘤细胞增殖减少、内源性凋亡通路优先激活以及NF-κB表达降低相关，提示抑制该促生存信号通路。此外，与诱导免疫抑制效应的5-FU相反，GA保留了血液学、肝脏和肾脏参数。总体而言，这些结果表明，GA兼具显著抗肿瘤活性和良好安全性特征，支持其作为辅助癌症治疗的有前景候选物。