工业规模黑水虻幼虫（BSFL）转化食物垃圾的One Health评估：真菌毒素生物累积与产毒真菌

《Journal of Agriculture and Food Research》：Valorising food waste using black soldier fly larvae: A One Health assessment of mycotoxin bioaccumulation and mycotoxigenic fungi under industrial-scale conditions

　　

利用黑水虻幼虫（black soldier fly larvae, BSFL）对食物垃圾进行增值：工业规模条件下真菌毒素（mycotoxins）生物累积与产毒真菌（mycotoxigenic fungi）的One Health评估。黑水虻幼虫在工业条件下以食物垃圾饲养；幼虫中镰刀菌属（Fusarium）、曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）大多低于检测限（limit of detection, LOD）；脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）和HT-2毒素（HT-2 toxin）在基质中检出，但在幼虫中未检出；生物累积因子（bioaccumulation factor, BAF）<1，证实无真菌毒素累积。

研究背景：全球每年超过10亿吨食物被浪费，影响环境可持续性和粮食安全；填埋和焚烧可产生温室气体、异味并促进病原体传播；2050年全球人口预计达97亿，亟需替代和可持续蛋白来源。One Health（同一健康）强调人类、动物和环境健康相互联系。昆虫养殖符合该框架，黑水虻幼虫（black soldier fly larvae, BSFL）可将食物垃圾转化为高质量蛋白，并生产动物饲料、肥料、生物燃料、药品和化妆品。但欧盟不允许含肉或鱼的前食品作为昆虫基质（Regulation (EC) No 1069/2009）；欧洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）指出这些基质可能被真菌和真菌毒素（mycotoxins）污染。真菌毒素可造成胃肠、肾脏、免疫、神经、致癌、生长和生殖损害。主要产毒真菌（mycotoxigenic fungi）包括 Aspergillus、Fusarium、Penicillium、Claviceps 和 Alternaria，可产生黄曲霉毒素（aflatoxins, AFTs）、赭曲霉毒素（ochratoxins, OTs）、单端孢霉烯族毒素（trichothecenes, TCTs）、伏马菌素（fumonisins, FUMs）、ZEN、展青霉素（patulin, PAT）、橘霉素（citrinin, CT）和麦角生物碱（ergot alkaloids, EAs）。废物管理环境已记录暴露于DON、ZEN、赭曲霉毒素A（ochratoxin A, OTA）、HT-2毒素、α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol, α-ZOL）和β-玉米赤霉烯醇（β-zearalenol, β-ZOL）。此前研究表明BSFL不生物累积真菌毒素，但多数证据来自人工污染基质，不能完全再现真实食物垃圾的异质性和自然污染。既往真菌评估多依赖总霉菌和酵母计数，不识别产毒潜力；产毒真菌存在不一定对应毒素。为此，研究人员在工业规模条件下，用异质性自然污染食物垃圾、无人工加标，评估BSFL中真菌毒素发生和生物累积，并同时鉴定和计数产毒真菌，以提供One Health框架下更现实的风险评估。

关键技术与方法：研究在葡萄牙 EntoGreen R&D unit（Santarém）进行工业规模生物转化。测试基质为1847.5 kg来自Santarém九家餐厅的消费前和消费后食物垃圾，与麦麸混合至水分65-67%；对照为Gainesville diet。BSFL接种后饲养14天，测试114个、对照144个PVC容器。第1天收集初始基质，第14天收集筛分后幼虫、frass和干燥研磨meal。样本三次生物学重复，每分析物四技术重复。真菌用麦芽提取物琼脂（Malt Extract Agar, MEA）和二氯苯胺甘油琼脂（Dichloran Glycerol Agar, DG18），在27 °C和37 °C培养，形态学鉴定，结果以log₁₀ CFU/g表示，LOD为1.8 log₁₀ CFU/g。真菌毒素用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography–tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）分析16种毒素及代谢物，按Regulation (EU) 2023/2782，并计算BAF。统计用IBM SPSS，Mann–Whitney U检验，p < 0.05。

研究结果：在MEA上，对照和测试组真菌污染总体低。对照组 F. culmorum、F. graminearum、Aspergillus section Nigri 在基质和幼虫间无显著差异；Mucorales在基质（6.11 log₁₀ CFU/g）显著高于幼虫（2.43 log₁₀ CFU/g；p = 0.002）；A. fumigatus两者低于LOD。测试组无任何分析真菌显著差异；Penicillium spp.和Aspergillus section Flavi两者低于LOD。在DG18 27 °C，对照组 F. graminearum 在基质检出（2.6 ± 0.2 log₁₀ CFU/g），幼虫低于LOD，差异显著（p = 0.002）；A. section Nigri在幼虫检出（2 ± 2 log₁₀ CFU/g），基质未检出；A. sections Flavi、Circumdati、Penicillium spp.等无显著差异。测试组 Penicillium spp.在基质（2.6 ± 0.2）和幼虫（2.6 ± 0.3）检出，无显著差异（p = 0.065）；A. sections Nigri、Flavi、Circumdati低于LOD。在DG18 37 °C，真菌生长有限。对照组 A. section Nigri 仅在幼虫检出（2.4 ± 0.0 log₁₀ CFU/g），基质低于LOD，差异显著（p = 0.002）；A. section Flavi 两者低于LOD。测试组 A. section Nigri 和 A. section Flavi 均低于LOD。真菌毒素分析显示，对照组仅DON、ZEN和HT-2在至少一种基质中高于LOD或定量限（limit of quantification, LOQ）。测试组仅ZEN高于LOD/LOQ。其他所有毒素和代谢物低于LOD/LOQ；两组meal中所有毒素低于LOD/LOQ。对照组DON基质164 ± 4 μg/kg，frass 260 ± 10 μg/kg，幼虫低于LOQ（26.0 μg/kg），BAF 0.081；ZEN基质16 ± 2 μg/kg，frass 32.4 ± 0.0 μg/kg，幼虫低于LOD（0.5 μg/kg），BAF 0.81；HT-2基质21 ± 1 μg/kg，幼虫和frass低于LOD（3.8和4.1 μg/kg），BAF 0.092。测试组ZEN基质3.4 ± 0.2 μg/kg，frass 7.4 ± 0.7 μg/kg，幼虫低于LOD（0.5 μg/kg），BAF 0.047。所有BAF < 1，表明无生物累积并支持生物转化中污染物总体减少；对照组DON、ZEN、HT-2无生物累积显著（p < 0.001），测试组ZEN无生物累积显著（p < 0.001）。

讨论与结论：讨论指出，多数真菌物种、培养基和温度下基质与幼虫无显著差异，真菌计数常低于LOD，尤其幼虫，与既往BSFL食物废物流观察一致。对照为谷物基质，测试为混合食物垃圾，组成和来源不同，预期真菌谱不同；不同有机废物可改变BSFL肠道细菌和真菌群落。个别显著效应主要在对照组，表明基质真菌不易转移至幼虫；Kuznetsova et al.和Alagappan et al.有类似观察。但模式不统一，Mucorales在幼虫显著低于基质，Penicillium无显著差异，提示转移或持续可能分类群依赖；机制未研究，应视为假设。BSFL抗菌肽和脂质衍生物如月桂酸、单月桂酸甘油酯可能抑制微生物；frass可抑制植物病原真菌。气候变化利于真菌病原体扩展和毒素污染，唑类杀菌剂抗性出现，BSFL抗真菌特性可能作为补充策略。局限是形态学鉴定无分子确认。基质天然低浓度毒素，多数低于检测/定量限，符合欧盟法规。对照 F. graminearum 与DON、ZEN一致；测试ZEN检出但Fusarium很低或低于LOD，可能反映残留污染；Penicillium检出但OTA低于LOD，可能浓度低或条件不利。产毒真菌存在不一定对应毒素。幼虫中真菌毒素低于检测/定量限，BAF远低1，无生物累积，类似黄曲霉毒素和镰刀菌毒素研究。DON、FB1、FB2、ZEN在基质但在幼虫大多缺失，随frass排泄；本研究frass检出，但幼虫未禁食，不能排除残留未消化基质；无完整质量平衡，不能完全确定分布。frass中DON、ZEN高于初始基质可能因基质消耗和残留物减少的被动浓缩。未检出母体毒素不排除转化为未靶向代谢物；AFB1有生物转化证据，产生aflatoxin P1和aflatoxicol，转录组显示BSFL调节xenobiotic metabolism基因，但不能外推至DON、ZEN、HT-2。One Health角度，frass中残留毒素值得注意，可能作为有机肥料进入土壤；无生物累积不等于所有输出无风险。无生物累积可由幼虫解毒和相关微生物群落活动解释。与多数人工污染研究不同，本研究工业规模、异质自然污染食物垃圾，更现实。主动缓解策略包括去除可见污染基质、控制温湿度和适当储存饲料及产品。结论翻译：本研究证明，在所评估实验条件下，工业规模条件下以自然污染食物垃圾饲养的BSFL未在生物量中生物累积所测试真菌毒素。使用异质性自然污染食物垃圾在工业规模饲养条件下提供了行业相关评估，补充了先前主要基于人工污染基质的研究。对整个生物转化系统中真菌毒素和潜在产毒真菌的综合评估进一步强化了这些发现从One Health角度的相关性。然而，研究基于单一地理位置收集的单一食物垃圾混合物和一个饲养周期，观察到的真菌毒素浓度相对低，限制外推到污染更高基质。真菌鉴定依赖形态学，结论限于所测试条件下所研究真菌毒素。幼虫采样前无禁食期，解释输出中真菌毒素分布时应考虑，因为残留未消化基质可能影响回收frass组成。未来应评估不同食物废物流、污染水平和饲养周期，纵向多时间点采样，而非仅初始基质和最终幼虫；禁食后分析frass结合完整质量平衡可阐明排泄、降解、生物转化和被动浓缩贡献；靶向和非靶向分析代谢物和转化产物，结合分子确认真菌鉴定，将强化机制理解和安全评估。