基于天然配体结合构建的蛋白质-聚合物动态水凝胶：用于可注射治疗递送与3D打印

《Advanced Healthcare Materials》：Protein-Polymer Dynamic Hydrogels Utilizing Native Ligand Binding for Injectable Therapeutic Delivery and 3D Printing

摘要专业翻译 由可逆相互作用形成的动态水凝胶，在包封治疗药物的微创递送以及组织模拟结构的挤出式3D打印中展现出应用价值。本研究报道了由球形超支化聚甘油（HPG）与可溶性白蛋白纳米颗粒（SANs）共组装形成的动态纳米胶体水凝胶。研究人员对HPG进行棕榈酸酯（血清白蛋白的天然配体）功能化修饰，该修饰能够促使HPG发生自缔合，并实现其与SANs的相互作用，从而形成动态网络。通过调节SAN的尺寸以及其他制剂参数，可对这些网络的性能进行调控。为突出这些动态水凝胶的应用价值，研究人员展示了：（i）这些可注射材料在体外和体内对模型蛋白治疗药物的释放行为；（ii）在小鼠模型中对这些材料的生物相容性进行初步评价；（iii）利用这些材料实现基于挤出的3D打印。

论文解读文章

一、研究背景与意义

动态水凝胶因其在可注射细胞递送、药物递送和3D生物打印等领域的广泛应用而受到持续关注。这类材料凭借其可逆的动态网络结构，表现出复杂的黏弹性特征，能够在静止状态下呈现类固体行为，而在受到应力作用时转变为类液体状态，从而实现注射或挤出。然而，目前文献中报道的多数动态水凝胶系统在兼具复杂流变学性能与特定生物功能方面仍面临挑战，尚不存在公认的“金标准”动态水凝胶体系。值得注意的是，利用生物分子识别（如特异性蛋白质-配体相互作用）构建动态网络的水凝胶系统此前鲜有报道，且已有报道多依赖工程化肽段或重组蛋白，这可能限制其规模化生产和可及性。

血清白蛋白作为脊椎动物体内含量最丰富的可溶性蛋白，具有易于纯化、成本低廉、生物相容性好、可酶解降解以及高水溶性等优点。尤为重要的是，血清白蛋白对长链脂肪酸具有多价（≤ 6 M M^?1）且高亲和力（K_A ～ 1–69 × 10⁷ M^?1）的结合能力。本研究正是利用这一天然配体结合功能，构建了基于蛋白质-聚合物相互作用的动态纳米胶体水凝胶，为可注射治疗递送和3D打印提供了新型材料平台。该研究成果发表于《Advanced Healthcare Materials》。

二、主要关键技术方法

研究人员采用了以下主要技术方法：通过开环聚合合成球形超支化聚甘油（HPG），并利用棕榈酰氯对其进行化学修饰，获得棕榈酸酯功能化的HPG-C16；采用戊二醛交联法在稀溶液中制备不同粒径（约30 nm、45 nm和60 nm）的可溶性白蛋白纳米颗粒（SANs）；利用动态光散射（DLS）表征材料尺寸分布；利用圆二色（CD）光谱验证SANs中白蛋白的α-螺旋二级结构保留；通过流变学系统表征水凝胶的黏弹性、剪切变稀、触变性和自愈合行为；采用注射力测量评估材料的临床可注射性；通过直接墨水书写（DIW）技术进行3D打印；通过体外和体内实验评估模型蛋白免疫球蛋白G（IgG）的释放行为及材料生物相容性。动物实验使用雌性SKH1-Elite无毛小鼠（6–8周龄，购自Charles River Laboratories）。

三、研究结果

3.1 HPG作为携带配体的纳米颗粒构建单元

研究人员合成了Z-均流体力学直径d_H ≈ 14 nm、分散度约0.04的HPG，并在约0.7%的羟基上接枝棕榈酸酯基团（HPG-C16）。在≥ 15 wt%聚合物含量下可获得稳健的动态水凝胶，15 wt% HPG-C16凝胶的储能模量G' ≈ 6800 Pa，tan δ ≈ 0.13，表观屈服应力σ_y ≈ 130 Pa（ω = 10 rad s^?1）。研究发现，HPG-C16与单体BSA的混合物呈黏性液体而非凝胶状态，表明单体BSA与HPG-C16之间的相互作用不利于形成自支撑网络。当BSA预先以游离棕榈酸饱和后，混合物表现出类凝胶行为，证实了BSA通过棕榈酸酯基团与HPG-C16发生相互作用。

3.2 SANs实现有效的蛋白质-聚合物网络形成

研究人员制备了d_H ≈ 30 nm（SAN-30）、45 nm（SAN-45）和60 nm（SAN-60）的SANs，CD光谱证实其保留了血清白蛋白特征性的α-螺旋二级结构。将SAN-45与HPG-C16以3:2质量比混合，在15 wt%总浓度下观察到凝胶形成（15-(3:2)-45），该凝胶G' ≈ 2200 Pa，tan δ ≈ 0.42，σ_y ≈ 270 Pa。当SANs预先以棕榈酸饱和后，凝胶的流变行为发生显著改变，证实SANs具有棕榈酸结合活性且该相互作用可被竞争性抑制。

3.3 动态纳米胶体水凝胶的流变表征与调控

系统流变学研究表明：随着总浓度从10 wt%增加至20 wt%，黏度、储能模量和屈服应力持续增加，20 wt%凝胶虽具有更强的弹性和剪切变稀行为，但过高的抗剪切阻力不利于注射操作。改变SAN与HPG-C16的质量比（7:3、3:2、1:1）时，增加HPG-C16含量可提高弹性特征和剪切变稀程度。增大SAN尺寸（从SAN-45到SAN-60）可适度增加弹性特征和剪切变稀行为。最终选定的15-(1:1)-60配方（15 wt%总浓度、SAN-60与HPG-C16质量比1:1）表现出G' ≈ 3400 Pa，tan δ ≈ 0.33，σ_y ≈ 170 Pa，在静止时具有良好稳定性且在适度剪切下具有良好的流动性。多步振荡测试证实两种凝胶均表现出触变性和快速自愈合行为。温度扫描（5–50°C）显示凝胶在37°C下仍保持良好机械稳定性。

3.4 动态纳米胶体水凝胶的可注射性与可挤出性

注射力测量显示，使用23 G针头时，15 wt% HPG-C16凝胶、15-(3:2)-45凝胶和15-(1:1)-60凝胶的注射力均低于10 N；使用27 G针头时，前两者的注射力低于20 N，15-(1:1)-60凝胶约为22 N。相比之下，30 wt% Pluronic F-127凝胶在23 G针头下注射力约15 N，但在27 G针头下升至约66 N，超出临床适用范围。DIW 3D打印实验表明，15-(3:2)-45配方可实现平滑一致的挤出，15-(1:1)-60配方则更适合多层结构的打印。

3.5 凝胶的高稳定性与包封货物的缓释

溶解实验表明，在1X PBS中31.5天后，15 wt% HPG-C16凝胶质量损失最低（6.4%），15-(3:2)-45和15-(1:1)-60凝胶分别为24%和15%。在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM中，SAN的引入显著提高了凝胶的稳定性，15-(3:2)-45和15-(1:1)-60凝胶31.5天质量损失分别为71%和40%，而纯HPG-C16凝胶达87%。体外IgG释放实验显示，15-(1:1)-60凝胶释放最慢，31.5天累计释放约80%。

3.6 体内模型治疗药物释放与生物相容性

体内荧光成像（IVIS）显示，15-(1:1)-60凝胶在注射后48小时保留约95%的最大荧光值，7天后仍保留约70%，显著优于PBS对照组（48小时后降至约20%）。组织病理学评估显示，水凝胶注射部位出现不同程度的巨噬细胞浸润（Group 2明显、Group 3和4中度），未见明显的中性粒细胞炎症、坏死或出血。血液学和血清生化检测未发现一致的系统性异常。初步评估表明这些水凝胶材料具有良好的体内生物相容性。

四、结论

本研究利用最易获得的蛋白质之一——牛血清白蛋白（BSA）的长链脂肪酸结合功能，合成了新型可注射/可挤出水凝胶，并通过该天然配体相互作用实现了凝胶流变性能的调控。研究同时展示了HPG作为单分子纳米颗粒在向血清白蛋白物种呈递配体以形成纳米胶体网络方面的应用价值。虽然疏水修饰的HPG单独即可形成稳健的动态水凝胶，但白蛋白纳米颗粒的引入进一步实现了水凝胶流变性能的调控、提高了其在含血清培养基中的稳定性，并延长了包封货物在体内的释放时间。未来工作将致力于针对治疗递送和生物制造领域的特定应用进一步优化这些材料。