生物分析中混合型和多模式HPLC固定相：结构-性质-性能关系、权衡、应用及未来展望

《Journal of Chromatography B》：Hybrid and multimodal HPLC stationary phases in bioanalysis: structure–property–performance relationships, trade-offs, applications, and future perspectives

# 混合HPLC柱技术在药物分析和生物分析中的应用：关键评估

## 摘要要点

- 关键评估混合HPLC柱技术在药物和生物分析中的应用
- 关联固定相设计与色谱效率、选择性、稳健性以及LC-MS/MS兼容性
- 比较BEH、核壳型、整体柱、聚合物及混合模式混合柱之间的性能权衡
- 总结药物定量、治疗药物监测、药代动力学研究、生物标志物分析、蛋白质组学、代谢组学及药物质量控制中的循证应用
- 识别混合固定相技术在现代生物分析中的当前局限、标准化需求及未来方向

## 引言

生物分析是药物开发和临床研究的基础，它能够在复杂生物基质中可靠地定量药物、代谢物、生物标志物及内源性化合物[1]。准确的生物分析测量对于药代动力学和药效动力学研究、生物利用度和生物等效性研究、治疗药物监测、生物标志物验证、毒理学评价以及监管决策至关重要[2]。生物样本复杂性的增加，加上对更低检测限、更高分析选择性和更高样品通量的需求，大幅提高了对色谱分离的性能要求[3]。因此，液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）已成为定量生物分析的首选平台[4], [5]。然而，LC-MS/MS方法的总体性能仍然强烈依赖于色谱分离，使得固定相的选择成为分析可靠性、稳健性和重现性的关键决定因素[6]。因此，柱技术的持续进步对于提高生物分析性能变得必不可少，而不仅仅是提高色谱效率[7]。

高效液相色谱（HPLC）的进展在很大程度上得益于固定相设计的持续创新[8]。从传统的完全多孔硅胶颗粒向亚2 μm颗粒、整体柱、表浅多孔（核壳）颗粒以及超高效液相色谱（UHPLC）的转变，显著改善了分离效率、色谱分辨率和分析通量[9]。尽管取得了这些进步，但没有任何单一柱技术能够同时提供最大效率、宽pH稳定性、低运行压力、高选择性以及与多样化生物分析应用的通用兼容性[9], [10]。这些剩余的挑战推动了混合固定相的开发，即将无机二氧化硅与有机结构组分集成，以改善机械稳定性、化学耐久性和色谱稳健性[10]。混合柱平台不是取代现有技术，而是通过提供具有应用特定性能优势的途径来扩展分析工具箱，这些优势在纳入常规生物分析之前需要关键评估[8], [10]。

现代HPLC柱技术不应被视为一系列等效技术的线性序列，因为不同的术语描述的是不同的设计维度。固定相化学是指分离介质的化学组成和表面功能特性，而颗粒架构描述的是物理形态，如完全多孔或表浅多孔颗粒[11]。整体柱代表的是连续多孔架构，而不是颗粒填充形式[12]。相比之下，UHPLC描述的是一种以高压输送、低分散系统设计和能够支持快速高效分离的柱为特征的仪器和操作模式[13]。混合模式色谱主要指固定相中存在两种或多种保留机制。因此，核壳颗粒本身并非混合材料，在UHPLC条件下运行的柱子也不一定就是混合柱[14]。

在这个多维框架内，混合固定相主要通过其材料化学来定义，特别是有机和无机结构组分的集成或其他互补材料的融合[15]。这种混合化学可以实施在完全多孔、表浅多孔、整体或复合架构中，并且可以包含单一模式或混合模式保留机制。这一区分提供了更严格的比较现代HPLC柱的基础，避免将化学、形态、操作模式和保留机制视为可互换的分类[16]。

色谱方法的分析性能主要由固定相的物理化学特性决定[8], [17]。尽管传统的硅胶基柱在药物分析中仍然被广泛使用，但其实际应用可能受到有限的pH稳定性、渐进性水解降解、缩短的运行寿命以及实现最大效率所需的高液压压力的限制[10], [18]。在药物和生物分析工作流程中，这些限制变得越来越重要，因为复杂生物基质需要稳健、可重现且高通量的分析方法[18]。

混合HPLC柱技术通过理性工程化颗粒组成、孔结构和表面化学来解决这些挑战[19]。有机-无机混合颗粒、桥联乙烯基混合（BEH）材料、表浅多孔（核壳）颗粒、混合整体柱、聚合物混合固定相和混合模式固定相各自在色谱效率、选择性、压力耐受性、化学稳定性和LC-MS兼容性方面提供了独特的优势[17], [20]。然而，没有任何单一混合固定相技术在所有分析应用中都是普遍优越的[21]。其性能取决于多个相互作用的因子，包括分析物的物理化学特性、样品基质复杂性、色谱条件、仪器配置和检测策略[22]。因此，混合固定相的选择应受到应用特定分析目标和循证性能评估的指导，而不是仅凭色谱效率[23]。

## 机制视角

混合固定相的分析性能源于由颗粒形态、孔结构、表面化学和传质特性决定的明确结构-性质关系[24]。这些相互关联的结构属性共同决定色谱效率、选择性、压力耐受性、分析物与固定相的相互作用，以及与LC-MS/MS等高级检测平台的兼容性[25], [26]。这些性能特性背后的物理化学机制在第3.8节中进行了关键讨论。

先前的综述为理解现代液相色谱的各个维度提供了重要基础。关于混合模式固定相的综述强调了多模态保留化学的发展及其应用，而关于核壳颗粒和整体柱载体的综述则主要考察了颗粒架构、动力学性能和传质特性。更广泛的固定相载体综述随后纳入了颗粒工程和柱格式方面的进展。最近，专门的综述讨论了共价有机框架（COF）和金属有机框架（MOF）等新兴材料作为色谱固定相。这些贡献大大推进了该领域的发展，但其主要关注点仍然是特定的材料类别、颗粒架构或分离模式，而非它们在生物分析方法选择中的综合评估。

本综述在范围上有所不同，将固定相组成、颗粒形态、色谱操作模式和保留机制视为相互独立但相互关联的设计维度。核心的结构-性质-性能框架将这些维度与可测量的色谱结果联系起来，包括效率、传质行为、选择性、操作压力、化学稳定性、峰形、LC-MS/MS兼容性和方法实际稳健性。此外，本综述明确评估了性能权衡，而不是假设色谱参数的单一改进就代表整体技术优越性。这些权衡包括效率与反压、分辨率与通量、选择性与稳健性、灵敏度与基质效应以及柱寿命与成本之间的关系。

进一步的贡献是面向应用的这些关系在药物和生物分析工作流程中的解释。本综述在讨论柱选择时考虑了分析物特性、生物基质复杂性、仪器能力、方法转移需求和监管考量，而不仅仅是根据理论色谱性能来对技术进行排名。新兴的COF基、MOF基、水凝胶基和混合模式固定相也被纳入其中，以在快速发展的下一代色谱材料格局中定位已建立的混合材料。

本综述从分离科学的角度对混合HPLC柱技术进行了关键评估，将固定相工程的进展与色谱性能和实际生物分析应用相结合。本综述首先总结了当前混合固定相的分类和物理化学特性，然后考察颗粒形态、孔结构、表面化学和传质机制如何决定色谱效率、选择性、稳健性和压力耐受性。随后分析了具有代表性的对比研究，以评估不同混合柱技术在药物和生物分析应用中相关的性能权衡。

本综述不是在孤立中描述各种固定相技术，而是对竞争的混合柱平台进行了关键比较，评估了现有证据的强度和局限性，识别了未解决的方法学挑战，并讨论了未来的研究重点，包括标准化的性能评估、可持续的固定相设计以及人工智能辅助的色谱方法开发。通过将材料工程与分析性能及应用特定需求相关联，本综述为在现代药物和生物分析实验室中选择混合HPLC柱提供了实用指导。尽管在必要时引入了一些通用色谱科学原理，但这些概念主要被讨论以解释材料化学、颗粒架构、保留机制和操作条件如何影响混合和多模式固定相的性能。因此，本综述将通用色谱原理用作机制基础，而非对传统HPLC柱技术进行独立的综述。

本文设计为关键性叙述综述，而非系统综述或荟萃分析。使用Scopus、Web of Science、PubMed和ScienceDirect进行了有针对性的文献检索，以识别与混合HPLC固定相、颗粒架构、保留机制、色谱性能、生物分析应用和新兴固定相材料相关的文献。最终文献检索于2026年9月27日完成。

检索策略将相关术语与布尔运算符结合使用。主要检索概念包括"混合HPLC"、"混合固定相"、"有机-无机固定相"、"桥联乙烯基混合"、"BEH"、"核壳"、"表浅多孔颗粒"、"混合模式色谱"、"混合模式固定相"、"整体柱"、"聚合物固定相"、"共价有机框架"、"COF"、"金属有机框架"、"MOF"、"水凝胶固定相"、"生物分析"、"LC-MS/MS"、"药物分析"和"固定相选择性"。

检索主要涵盖了2020年1月至2026年9月27日的出版物，当较早的出版物提供了必要的机制、历史或技术背景时则予以保留。优先考虑同行评审的主要研究论文、机制研究、柱对比评价、权威综述以及固定相设计的最新进展。当文献涉及固定相组成、颗粒或柱架构、保留机制、色谱性能、化学稳定性、LC-MS兼容性或药物和生物分析应用时，视为相关文献。

由于现有研究在分析物类别、柱尺寸、粒径、固定相化学、流动相组成、仪器、检测方法和报告的性能指标方面存在显著差异，因此证据进行了定性综合。未进行定量荟萃分析。

## 章节摘录

### 混合HPLC柱的定义

在本综述中，"混合HPLC固定相"一词主要用于描述将两种或多种化学上不同的组分整合在材料或表面架构中以产生互补物理化学特性的固定相[27]。最成熟的例子是将有机结构单元纳入或共价集成到基于无机二氧化硅的骨架中的有机-无机混合材料[28]。桥联乙烯基混合（BEH）材料是这一类别中最早得到广泛采用的实例之一。

### HPLC柱技术的演变

高效液相色谱（HPLC）柱技术的演变是由药物和生物分析应用中对更快、更高效和更具选择性分离日益增长的需求所驱动的[62], [63]。传统的硅胶基填充柱构成了现代HPLC的基础，因为它们在分离性能和适用广度方面表现令人满意。然而，它们相对狭窄的操作pH范围和易受水解降解的影响限制了其在某些应用中的表现。

### 混合HPLC柱的性能权衡

高级HPLC柱之间的性能比较需要考虑几个相互依赖的参数，而非识别一种普遍优越的技术[44], [141]。颗粒架构、固定相化学、孔结构、表面官能团、保留机制、柱尺寸和操作条件的差异可以同时影响效率、选择性、压力、分析时间、稳健性和LC-MS响应[142]。因此，不能简单地将某一单一参数上的优势等同于整体技术优越性。

### 药物定量

药物定量是混合HPLC技术在药物和临床生物分析中最重要应用之一[162]。在血浆、血清、尿液和组织等生物基质中准确测定药物浓度对于药物开发、剂量优化、治疗监测和监管生物等效性研究至关重要[163], [164]。混合固定相，特别是桥联乙烯基混合（BEH）技术和混合表面技术，在该领域展现了显著优势。

### 当前挑战

尽管混合HPLC柱技术取得了显著进步，但仍有若干科学、技术和实际挑战影响着它们在药物和生物分析实验室中的常规实施[202]。解决这些局限性对于改善分析重现性、促进监管接受和支持下一代混合固定相的持续发展至关重要。

### 未来展望

药物和生物分析科学的持续演进预计将推动具有可重现效率、可持续性和分析智能的下一代混合HPLC柱的开发[98]。未来的创新很可能将先进材料、绿色分析原理、人工智能（AI）和自动化分析平台整合在一起，以克服当前局限同时支持一致的高通量和精确实时的生物分析[225], [226]。

### 本综述的局限性

在解释本综述的结论时应考虑几个局限性。首先，本文是一篇关键性叙述综述，而非系统综述或荟萃分析。尽管使用了有针对性的文献检索来识别相关出版物，但该研究未采用正式的系综评审方案、定量偏倚风险评估或荟萃分析综合。

其次，由于已发表研究在分析物类别、柱尺寸、粒径、固定相化学、流动相组成、仪器、检测方法和报告的性能指标方面存在显著差异，因此高级HPLC固定相之间的直接比较仍然困难。

## 结论

混合HPLC柱技术通过改善色谱效率、选择性、稳健性以及UHPLC和LC-MS/MS平台的兼容性，显著推动了生物分析的发展。

混合颗粒工程和固定相化学的进步使得对复杂生物基质的可靠分析成为可能，从而支持了药物定量、治疗药物监测、药代动力学研究、生物标志物分析以及药品质量控制等方面的应用。然而，没有。CRediT作者贡献声明：Ramesh D. Ingole：写作——审阅与编辑、概念化。Rahulkumar D. Rahane：写作——审阅与编辑、调查。Shilpa S. Kolhe：写作——审阅与编辑、监督、方法学。Hemant A. Deokule：写作——审阅与编辑、监督。Jeevan R. Rajguru：写作——审阅与编辑、验证。Annasaheb S. Gaikwad：写作——原稿撰写、可视化、验证、监督、项目管理、方法学、调查、概念化。参与同意：不适用。出版同意：不适用。伦理审批：不适用。本文是对先前已发表研究的综述，不涉及人类参与者或实验动物。资助：作者在撰写本综述期间未获得公共、商业或非营利部门任何资助机构的特定财务支持。利益冲突声明：作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能被认为会影响本文所报告的工作。Ramesh D. Ingole|Rahulkumar D. Rahane|Shilpa S. Kolhe|Hemant A. Deokule|Jeevan R. Rajguru|Annasaheb S. Gaikwad