《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Nanocellulose-based pH-responsive reversible flocculants for microalgae harvesting studied using atomic force spectroscopy
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•用于微藻收获的可逆 pH 响应纳米纤维素基絮凝剂•在受控 pH 下实现 93% 的絮凝效率和 71% 的解絮凝效率•AFM 揭示了纳米尺度的絮凝剂 - 细胞相互作用机制•AFM 显示在高 pH 下力降低了两个数量级•高分辨率 AFM 证实絮凝剂从细胞表面脱落引言微藻是满足食
• 用于微藻收获的可逆 pH 响应纳米纤维素基絮凝剂
• 在受控 pH 下实现 93% 的絮凝效率和 71% 的解絮凝效率
• AFM 揭示了纳米尺度的絮凝剂 - 细胞相互作用机制
• AFM 显示在高 pH 下力降低了两个数量级
• 高分辨率 AFM 证实絮凝剂从细胞表面脱落
引言 微藻是满足食品、饲料和可再生能源日益增长需求的生物量的一个有前景的来源 [1], [2]。然而，微藻的大规模生产仍面临显著的可扩展性挑战，并且成本依然高昂 [3], [4]。在这些挑战中，微藻生物量的收获是一个关键的瓶颈，原因在于培养生物质浓度低且细胞体积小。微藻细胞的小尺寸降低了过滤和离心等传统分离方法的效率。克服这一挑战的一种策略是通过絮凝诱导细胞聚集，形成较大的颗粒，从而更容易通过沉降或过滤进行分离 [5]。
虽然絮凝解决了一些传统收获方法的局限性，但也引入了新问题，主要是收获后生物质中残留絮凝剂的存在，这可能会干扰后续加工步骤并限制最终应用范围 [5], [6], [7]。为解决这一挑战，我们的目标是开发一种可逆絮凝剂，使其能在收获后从微藻生物质上脱离，从而避免污染生物质。可逆絮凝剂是一种在适当条件下与细胞相互作用以促进细胞 - 细胞聚集的材料。当条件改变时，絮凝剂产生排斥力，破坏细胞 - 细胞相互作用，并导致絮凝剂从细胞表面脱离。这可以通过使用对 pH 响应改变电荷的官能团来实现：在酸性条件下，絮凝剂带正电荷，与带负电荷的微藻细胞相互作用诱导聚集；而在碱性条件下，它带负电荷并从微藻细胞表面脱离 [8], [9]。文献中仅有限探索了这一策略，仅报道了少量用于微藻收获的可逆絮凝剂。例如，Xu 等人 (2023) 使用了一种基于壳聚糖和黄原胶络合的絮凝剂，可在低 pH 下实现栅藻 (Scenedesmus ) 的絮凝。在将 pH 调节至 11 后，观察到絮体解聚，但絮凝剂并未完全从生物质中去除 [9]。在另一项研究中，Morrissey 等人 (2015) 合成了一种基于 N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺和丙烯酸的 pH 依赖可逆絮凝剂。在他们的研究中，几种淡水和海洋微藻物种在低 pH 下絮凝，随后通过将 pH 提高至 12.5 进行解絮凝。在这种情况下，絮凝剂在絮凝后得以回收，并成功用于随后的絮凝周期 [8]。尽管 Morrissey 的工作在可逆絮凝剂设计方面取得了重大进展，但没有后续研究在此基础上扩展这一突破。
纳米粒子为设计絮凝剂提供了一个多功能平台，因为其表面化学性质可以精确设计以引入刺激响应功能。在此背景下，纤维素纳米晶 (CNCs) 因其生物基特性而具有吸引力。此外，其刚性和高长径比对絮凝过程有利 [10]。此外，CNCs 表面的羟基 enables 广泛的化学修饰 [11]，促进了针对微藻收获的定制化絮凝剂设计。尽管如此，只有少数尝试开发 pH 响应 CNCs。Eyley 等人 (2015) 通过硫酸水解纤维素合成了 pH 响应 CNCs（引入具有固定阴离子电荷的硫酸基团），然后用咪唑基团修饰 CNCs（在酸性 pH 下产生阳离子电荷）。虽然在 pH 为 4 时获得了有效絮凝，但当 pH 提高到 9 时，仅有 10-15% 的解絮凝 [12]。Ge 等人 (2016) 也使用了用咪唑基团修饰的 pH 响应 CNCs。他们成功地诱导低 pH 下的絮凝，并在高 pH 下重新分散细胞。尽管他们可以在絮凝后重新利用 CNCs，但第二轮所需剂量比初始剂量高一个数量级的事实表明回收效率很低 [13]。可能，高 pH 下阴离子电荷产生的静电排斥本身不足以使 CNCs 从微藻细胞表面脱离，可能需要额外的力来促进有效脱离。
为解决这些局限性，本研究的目的是开发一种结合静电排斥和空间位阻力的策略。为实现此目标，将聚丙烯酸 (PAA) 聚合物吸附到吡啶鎓改性的 CNCs (PYR-CNCs) 上，得到 [PAA]PYR-CNCs。在低 pH 下，PAA 链不带电荷且收缩，暴露出阳离子吡啶鎓基团。在高 pH 下，PAA 链带负电荷并具有伸展构象，屏蔽了吡啶鎓基团的永久性阳离子电荷，并促进絮凝剂从细胞表面脱离 [14]。该系统通过改变吸附到阳离子 CNCs 上的 PAA 链的分子量进行了优化。
先前的研究表明了 AFM 在微藻絮凝研究中的宝贵贡献 [15]，特别是用于理解微藻絮凝过程背后的纳米尺度机制 [16], [17], [18], [19]。在一项早期研究中，我们使用 AFM 力谱模式直接探测 PYR-CNCs 与普通小球藻 (Chlorella vulgaris ) 细胞表面之间的相互作用，揭示静电力在絮凝期间的聚集过程中占主导地位 [17]。在本研究中，我们使用 AFM 力谱定量测量 [PAA]PYR-CNCs 与普通小球藻 (C. vulgaris ) 细胞表面在低 pH 和高 pH 下的力。此外，我们使用高分辨率 AFM 成像演示 [PAA]PYR-CNCs 在高 pH 下从细胞表面脱落。
部分摘要 材料 棉花（德国药典级）购自 Chem-lab Analytical。4-(溴甲基) 苯甲酸 (97%) 和 HCl (37%) 购自 VWR。二氯甲烷 (GPR Rectapur)、乙醇 (99.8%，绝对) 和氢氧化钠 (≥98%，试剂级，颗粒状) 以及橙色 II（纯品）购自 Acros Organics。吡啶 (99.5%，超干) 购自 Fisher Scientific。对甲苯磺酰氯 (98%) 购自 Thermo Fisher。聚丙烯酸（钠盐）粉末 (2.1
吸附有 PAA 聚合物的吡啶鎓功能化 CNCs 的合成 本研究的目的是开发一种 pH 响应的 CNC 基可逆絮凝剂，使其能在絮凝后从生物质中去除。为此，原始 CNCs 经过吡啶鎓基团和 PAA 修饰。首先，将带有永久性正电荷的吡啶鎓基团接枝到 CNCs 上 [20]。随后，将 PAA 链吸附到阳离子 PYR-CNCs 表面以得到 [PAA]PYR-CNCs。PAA 链 (pKa = 4.5) 在低 pH 下不带电荷并具有卷曲构象
结论 本研究证明，将阳离子 PYR-CNCs 与 pH 响应 PAA 链结合，能有效诱导普通小球藻 (C. vulgaris ) 细胞对 pH 变化的絮凝和解絮凝，且在单循环过程中实现。PAA/PYR 比为 0.4 的 [PAA]PYR-CNCs 表现出最佳的 pH 响应行为，在 pH 5 时实现 93.2 ± 0.2% 的絮凝，在 pH 11 时实现 70.6 ± 1.2% 的解絮凝。力谱显示 pH 5 时存在强静电吸引，这在 pH
CRediT 作者贡献声明 Cécile Formosa-Dague: 撰写 - 审阅与编辑，监督，资源，方法论，资金获取，概念化。Wim Thielemans: 撰写 - 审阅与编辑，监督，资源，方法论，资金获取，概念化。Ayessa Pires Maciel: 撰写 - 审阅与编辑，撰写 - 初稿，方法论，调查，正式分析，数据整理。Koenraad Muylaert: 撰写 - 审阅与编辑，验证，监督，资源，方法论，资金获取，
利益冲突声明 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能影响本文报告的工作。
致谢 C. F.-D. 是法国国家科学研究委员会 (CNRS) 的研究员。感谢专门用于酶筛选和发现的 PICT-ICEO 设施，以及图卢兹综合筛选平台 (PICT, IBiSA) 的一部分，提供等离子体发生器的访问权限。PICT-ICEO 是欧洲研究基础设施 IBISBA 的法国节点 IBISBA-FR 的成员 (
https://doi.org/10.15454/08BX-VJ91) , 法国节点 IBISBA (
www.ibisba.eu) . PICT-ICEO 感谢 EquipEx+ ALADIN ANR-21-ESRE-0021 拨款提供的资金支持。
Ayessa Pires Maciel|Koenraad Muylaert|Wim Thielemans|Cécile Formosa-Dague
