作为“遗憾替代”的卤代阻燃剂 TDCPP 与 TDBPP 经 ATF3/SLC7A11/GPX4 轴触发铁死亡性肾滤过损伤

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Regrettable Substitutions: Halogenated Flame Retardants TDCPP and TDBPP Exploit the ATF3/SLC7A11 Axis to Trigger Ferroptotic Renal Filtration

　　

TDCPP/TDBPP 暴露导致斑马鱼幼鱼发育性肾毒性。有机磷酸酯阻燃剂（organophosphate flame retardants, OPFRs）暴露扰乱氧化还原平衡并促进脂质过氧化。线粒体损伤和溶酶体功能障碍放大铁死亡（ferroptosis）应激。ATF3（activating transcription factor 3）激活抑制 SLC7A11/GPX4 抗铁死亡轴。Fer-1（ferrostatin-1）和 ATF3 调控验证了铁死亡驱动的肾毒性。为回答相关问题，研究人员使用斑马鱼幼鱼表征 TDCPP/TDBPP 诱导的肾损伤，并使用 HEK-293T 细胞作为互补体外系统，研究铁死亡相关反应和 ATF3 相关调控。研究人员表征了铁死亡相关损伤关键特征，包括铁稳态破坏、脂质过氧化、线粒体超微结构改变和溶酶体功能障碍。此外，通过联合药理学干预、RNA 干扰和染色质免疫沉淀后定量 PCR（chromatin immunoprecipitation followed by quantitative PCR, ChIP-qPCR），研究人员证明暴露条件下 ATF3 在 SLC7A11 启动子的占用显著富集，支持 ATF3 激活与 SLC7A11 抑制之间的调控联系。总体而言，本研究评估铁死亡及既有 ATF3/SLC7A11/GPX4 调控通路参与 TDCPP/TDBPP 相关毒性，并为其环境健康风险提供额外机制证据。

论文解读文章

研究背景与科学问题

多溴二苯醚（polybrominated diphenyl ethers, PBDEs）被禁用后，有机磷酸酯阻燃剂（organophosphate flame retardants, OPFRs）成为全球主要替代品，产量快速增长，广泛用于电子产品、建筑材料、聚氨酯泡沫和消费品。由于 OPFRs 通常以物理添加而非化学键合方式进入聚合物基质，可通过日常磨损和挥发持续释放到环境。卤代 OPFRs，尤其 TDCPP（tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate）及其结构类似物 TDBPP（tris(2,3-dibromopropyl) phosphate），在室内灰尘、大气颗粒物和水生生态系统中频繁检出。基于人群的生物监测研究也在母血、尿液和胎盘组织中检测到 TDCPP 和 TDBPP 的关键代谢物，提示广泛而持续的人类暴露。尽管 TDBPP 因潜在致突变性在部分消费品中受到严格限制，TDCPP 仍被广泛使用。肾脏是负责外源物过滤、浓缩和排泄的主要器官，接受约 20% 心输出量，因而易受循环环境毒物影响。近期流行病学研究报道，尿 OPFR 代谢物浓度升高与慢性肾病（chronic kidney disease, CKD）或肾小球滤过功能受损发生率增加相关。毒理学证据显示，TDCPP/TDBPP 暴露可诱导发育异常、严重氧化应激、线粒体碎片化和凋亡。然而，既往研究多将这些下游病理事件视为孤立且平行的过程，能够将分散的细胞器水平损伤整合为统一肾毒性反应的上游分子调控机制仍不清楚。

铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性、非凋亡性细胞死亡，由过量脂质过氧化物积累驱动，是化学性器官损伤的重要介质。肾实质细胞具有高线粒体密度、高耗氧量和活跃铁转运机制，因而对铁死亡应激高度易感。尽管重金属和某些临床药物已被证明可通过铁死亡诱导肾损伤，但 TDCPP 和 TDBPP 等新兴替代阻燃剂是否及如何利用这一脆弱通路诱导肾毒性仍不清楚。系统 Xc^?（system Xc^?）–SLC7A11–GPX4 轴是抵御铁死亡的主要细胞防御屏障，阐明 OPFR 暴露下该轴的转录失调具有重要科学意义。激活转录因子 3（activating transcription factor 3, ATF3）是碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP）转录因子家族成员，作为可被环境应激、化学毒物和致癌损伤激活的快速反应因子。ATF3 传统上被视为短暂适应传感器，但在持续化学应激下，持续或过度 ATF3 激活可能使细胞命运转向病理结局。肿瘤生物学提示 ATF3 可负向调控 SLC7A11 转录，从而增加细胞对铁死亡的易感性。然而，TDCPP 和 TDBPP 暴露是否影响 ATF3 信号，以及 ATF3/SLC7A11/GPX4 轴是否参与由此产生的铁死亡相关反应，仍有待阐明。

研究人员开展的研究、主要结论及意义

研究人员使用斑马鱼幼鱼表征 TDCPP/TDBPP 诱导的肾损伤，并以 HEK-293T 细胞作为互补体外系统，研究铁死亡相关反应和 ATF3 相关调控。研究人员表征了铁死亡相关损伤的关键特征，包括铁稳态破坏、脂质过氧化、线粒体超微结构改变和溶酶体功能障碍。通过联合药理学干预、RNA 干扰和 ChIP-qPCR，研究人员证明暴露条件下 ATF3 在 SLC7A11 启动子的占用显著富集，支持 ATF3 激活与 SLC7A11 抑制之间的调控联系。总体而言，该研究评估了铁死亡及既有 ATF3/SLC7A11/GPX4 调控通路参与 TDCPP/TDBPP 相关毒性，并为其环境健康风险提供额外机制证据。其意义在于，TDCPP 和 TDBPP 最初作为 PBDEs 替代品引入，但研究提示替代 OPFRs 仍可能保留显著毒性潜力，体现“遗憾替代”概念，并为未来干预环境毒物诱导肾损伤提供潜在分子靶点。

关键技术方法概括

研究人员以野生型 AB 系斑马鱼（Institute of Life Sciences, Wenzhou University）及购自中国科学院水生生物研究所（Wuhan, China）的 Tg(XlEef1a1:mlsEGFP) 和 Tg(Eco.tshb:EGFP) 转基因斑马鱼为体内模型，以购自 Pricella（Wuhan, China）的 HEK-293T 细胞为体外模型。斑马鱼从 2 hpf 暴露至 10 dpf，TDCPP/TDBPP 设 10 和 100 μg/L；HEK-293T 暴露 10 和 100 μM 24 h，并用 1 μM Fer-1 干预。关键技术包括转基因荧光成像、FITC-Dextran 微注射、H&E、生化指标、CCK-8 和克隆形成、FerroOrange、Lyso-Tracker、C11-BODIPY、JC-1、ROS、RT-qPCR、ATF3 过表达/RNA 干扰、Western blot、免疫荧光、ChIP-qPCR 及分子对接/分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟。

研究结果

3.1 TDCPP 和 TDBPP 诱导斑马鱼幼鱼发育性肾毒性。研究人员通过形态观察、体长和 PS/BL 比定量、Tg(Eco.tshb:EGFP) 肾小管荧光成像、H&E 染色、肾损伤相关生化指标检测、RT-qPCR 以及 FITC-Dextran 清除实验发现，TDCPP 和 TDBPP 暴露导致斑马鱼幼鱼体长缩短、心包水肿、前肾管形态异常；肾小管荧光强度呈浓度依赖性下降；肾组织出现前肾小管管腔扩张、上皮细胞排列紊乱和细胞肿胀；血尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-glucosidase, NAG）、微量白蛋白（microalbumin, MAU）和总尿蛋白（total urinary protein, UTP）显著升高；wt1a 和 nphs1 下调，havcr1 上调；FITC-Dextran 清除减慢，肾小球滤过率（glomerular filtration rate, GFR）下降。结论是 TDCPP 和 TDBPP 暴露损害斑马鱼幼鱼肾脏排泄功能。

3.2 TDCPP 和 TDBPP 扰乱氧化还原稳态并促进脂质过氧化。在 HEK-293T 细胞中，暴露显著降低细胞活力并减少克隆形成能力。在细胞和斑马鱼幼鱼中，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性和谷胱甘肽（glutathione, GSH）水平显著下降，而丙二醛（malondialdehyde, MDA）和脂质过氧化产物（lipid peroxidation products, LPO）水平显著升高。荧光染色显示暴露细胞和斑马鱼幼鱼中活性氧（reactive oxygen species, ROS）过度积累。C11-BODIPY 染色显示氧化脂质绿色荧光显著增加、非氧化脂质红色荧光减少。结论是 TDCPP 和 TDBPP 在体外和体内均诱导明显氧化失衡和脂质过氧化。

3.3 TDCPP 和 TDBPP 诱导铁死亡相关线粒体异常和铁积累。透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）显示暴露 HEK-293T 细胞出现线粒体皱缩、嵴破坏或丢失、外膜密度增加等铁死亡样形态特征。JC-1 染色显示线粒体膜电位下降。在 Tg(XlEef1a1:mlsEGFP) 线粒体转基因斑马鱼中，暴露降低全身和前肾区域线粒体绿色荧光强度。细胞内 Fe²⁺ 水平在 HEK-293T 细胞和斑马鱼幼鱼中均显著升高。分子水平上，TDCPP 和 TDBPP 暴露显著抑制核心抗铁死亡蛋白 SLC7A11 和 GPX4 表达，其转录水平在斑马鱼幼鱼中也一致下调。结论是 SLC7A11/GPX4 防御轴破坏可能为 TDCPP/TDBPP 暴露后铁积累和脂质过氧化提供分子基础。

3.4 溶酶体稳态在 TDCPP/TDBPP 诱导的铁死亡损伤中破坏。Lyso-Tracker Red 染色显示暴露导致 HEK-293T 细胞溶酶体红色荧光强度浓度依赖性下降，提示溶酶体酸化和完整性受损。生化分析显示酸性磷酸酶（acid phosphatase, ACP）活性在 HEK-293T 细胞和斑马鱼幼鱼中均显著降低。RT-qPCR 显示维持溶酶体质子梯度和酸化的核心质子泵亚基 ATP6V1A、ATP6V1C2、ATP6V1H 转录水平显著下调，参与自噬清除和胞内货物运输的 NCOA4 和 LAMP2 也显著降低，而与溶酶体损伤和基质降解相关的蛋白酶 CTSB 表达显著升高。结论是 TDCPP/TDBPP 暴露下溶酶体稳态显著破坏。

3.5 抑制铁死亡减轻 TDCPP/TDBPP 诱导的肾毒性和细胞损伤。研究人员使用铁死亡抑制剂 Fer-1 进行药理学干预。Fer-1 共处理显著提高暴露斑马鱼幼鱼存活率，逆转肾损伤相关基因 wt1a 和 nphs1 下调及 havcr1 上调；在 HEK-293T 细胞中恢复细胞活力；降低 C11-BODIPY 氧化脂质信号并促进向非氧化脂质转变；抑制游离 Fe²⁺ 积累和 ROS 过度产生；部分恢复溶酶体酸化和线粒体膜电位。结论是铁死亡在介导 TDCPP/TDBPP 诱导的毒性效应中具有功能作用。

3.6 ATF3 在 TDCPP/TDBPP 暴露下激活并与 SLC7A11/GPX4 轴抑制相关。RT-qPCR 筛选显示暴露后促应激转录因子 ATF3 转录水平显著上调，而 p53 基本不变，Nrf2 仅在高浓度组出现适度代偿性增加。Western blot 确认 ATF3 蛋白水平显著升高。分子对接和 MD 模拟提示 TDCPP 和 TDBPP 对 ATF3 具有相对较强的预测结合亲和力，预测复合物结构稳定性较好，RMSD 波动有限并维持氢键贡献。免疫荧光显示 ATF3 异常激活和核转位，同时 SLC7A11 和 GPX4 荧光强度显著降低。转录调控预测识别出 SLC7A11 启动子区域存在典型 ATF3 结合基序。ChIP-qPCR 表明 TDCPP 和 TDBPP 暴露显著增加 ATF3 在 SLC7A11 启动子区域的占用。结论是 SLC7A11 可能是参与 ATF3 介导该通路破坏的重要转录调控靶标。

3.7 ATF3 RNA 干扰减轻 TDCPP/TDBPP 诱导的 HEK-293T 细胞铁死亡相关损伤。研究人员转染 si-ATF3 敲低 ATF3。Western blot 显示 ATF3 敲低显著逆转 TDCPP 和 TDBPP 诱导的 SLC7A11 和 GPX4 蛋白下调。伴随靶蛋白恢复，ATF3 敲低显著降低暴露诱导的细胞内 ROS 产生和游离 Fe²⁺ 积累，并降低 MDA 和 LPO 水平。此外，si-ATF3 部分逆转暴露相关的 WT1A、NPHS1 和 HAVCR1 转录水平变化，这些转录变化被视为细胞分子反应而非肾小管功能的直接指标。结论是 ATF3 敲低减弱 TDCPP/TDBPP 诱导的 HEK-293T 细胞铁死亡相关损伤。

3.8 ATF3 过表达加重 TDCPP/TDBPP 诱导的 HEK-293T 细胞铁死亡相关损伤。与敲低实验相反，ATF3 过表达进一步放大 TDCPP/TDBPP 诱导的 SLC7A11 和 GPX4 蛋白下调。在此条件下，细胞内 ROS 水平和游离 Fe²⁺ 积累较单独暴露进一步增加，MDA 和 LPO 积累也升高。此外，ATF3 过表达进一步改变 WT1A、NPHS1 和 HAVCR1 转录水平，这些变化被解释为细胞分子反应而非肾功能受损的直接证据。结论是过量 ATF3 表达增加 HEK-293T 细胞对 TDCPP/TDBPP 诱导铁死亡相关损伤的易感性。

讨论总结与研究结论翻译

讨论部分指出，既往 TDCPP 和 TDBPP 毒理学研究多将氧化应激、线粒体功能障碍、炎症和凋亡解释为相对独立的毒理学事件，而本研究表明这些病理变化可能是铁死亡损伤相互关联的表现。暴露后，斑马鱼幼鱼和 HEK-293T 细胞均表现 ROS 积累、GSH 耗竭、脂质过氧化增强和细胞内 Fe²⁺ 超载，这些生化特征与铁死亡高度一致，而非仅是非特异性氧化损伤。肾小管上皮细胞具有高氧化代谢需求和活跃铁处理能力，因此肾脏尤其易受铁死亡应激。除氧化失衡外，细胞器功能障碍可能进一步放大 OPFR 暴露期间铁死亡损伤。线粒体膜电位下降、线粒体荧光强度降低和结构异常表明线粒体稳态严重破坏；溶酶体荧光强度下降、ACP 活性降低和溶酶体相关基因表达失调进一步证实溶酶体功能障碍。Fer-1 干预部分恢复线粒体膜电位和溶酶体功能，同时降低 ROS 积累和 Fe²⁺ 超载，支持铁死亡相关氧化损伤促进 OPFR 暴露期间进行性细胞器功能障碍。分子水平上，研究支持 ATF3 参与 TDCPP/TDBPP 诱导的 HEK-293T 细胞铁死亡相关反应。暴露显著增加 ATF3 mRNA 和蛋白表达，而 p53 基本不变，Nrf2 仅有限激活，提示在本实验条件下 ATF3 可能比 p53 或 Nrf2 更显著参与 TDCPP/TDBPP 诱导的铁死亡相关调控。ATF3 表达增加伴随 SLC7A11 和 GPX4 显著抑制。SLC7A11 是 system Xc^? 的关键组分，负责胱氨酸摄取和谷胱甘肽合成，GPX4 解毒磷脂氢过氧化物；该通路抑制显著增加细胞对铁死亡的易感性。功能实验支持该调控关系：ATF3 敲低减轻 ROS 积累、Fe²⁺ 超载和脂质过氧化，而 ATF3 过表达加重这些铁死亡相关反应。基序预测和 ChIP-qPCR 显示 TDCPP/TDBPP 暴露后 ATF3 在 SLC7A11 启动子富集显著增加，提示 ATF3 可能直接参与 SLC7A11/GPX4 轴的转录抑制。ATF3 在该背景下呈现毒理学悖论：传统上作为短暂适应应激传感器保护细胞抵抗急性损伤，但在持续 OPFR 暴露下，持续 ATF3 激活可能转向促死亡调控状态，持续抑制抗氧化防御通路；Fer-1 干预后 ATF3 部分降低也提示铁死亡相关氧化产物可能通过正反馈机制进一步放大 ATF3 激活。讨论还指出若干局限：HEK-293T 细胞不能完全再现肾小管上皮细胞的分化表型和生理功能，需 HK-2 细胞、原代人肾小管上皮细胞或其他生理相关肾模型验证；ChIP-qPCR 支持 ATF3 在 SLC7A11 启动子富集，但直接转录抑制仍需荧光素酶报告和启动子突变分析验证；分子对接和分子动力学模拟属于计算预测，需表面等离子共振（SPR）、等温滴定量热法（ITC）或细胞热位移分析（CETSA）等生物物理方法验证 TDCPP/TDBPP–ATF3 直接相互作用；仍需哺乳动物长期低剂量暴露研究评估慢性环境健康风险；缺乏体内 ATF3 特异性遗传操作限制直接评价 ATF3 在 OPFR 诱导肾损伤中的病理贡献；不同肾单位细胞群体铁死亡易感性差异也需进一步研究。环境健康意义方面，TDCPP 和 TDBPP 最初作为 PBDEs 替代品引入，但研究提示替代 OPFRs 仍可能保留显著毒性潜力，体现“遗憾替代”概念；TDCPP 在多个实验终点一致诱导比 TDBPP 更强的毒性效应，提示卤素取代模式可能影响铁死亡易感性和肾毒性潜力，但精确构效关系尚待阐明。总体而言，该研究建立了从细胞器功能障碍和氧化还原失衡到转录调控的多层面机制框架，将环境 OPFR 暴露与铁死亡相关肾损伤联系起来。

研究结论翻译：综上所述，本研究证明，暴露于代表性卤代有机磷酸酯阻燃剂 TDCPP 和 TDBPP 可诱导铁死亡样病理改变，其特征为细胞内铁积累、过量 ROS 产生、脂质过氧化、线粒体去极化和溶酶体功能障碍，并伴随明显的肾结构异常和滤过功能受损。在细胞水平，TDCPP/TDBPP 暴露增加 ATF3 表达及 ATF3 在 SLC7A11 启动子的富集，伴随 SLC7A11/GPX4 抗氧化防御轴抑制。Fer-1 干预和 ATF3 功能调控进一步支持该通路参与 TDCPP/TDBPP 诱导的铁死亡相关细胞损伤。结合斑马鱼幼鱼中观察到的肾损伤，这些发现为 OPFR 暴露与铁死亡应激之间的关联提供了互补证据，尽管仍需在生理相关肾小管模型中验证。这些发现扩展了对替代有机磷酸酯阻燃剂相关健康风险的机制认识，并为未来干预环境毒物诱导肾损伤提供了潜在分子靶点。