二维与三维HepG2模型中细胞双酚A负荷与下游毒理学反应之间的模型依赖性解离

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Model-dependent dissociation between cellular bisphenol A burden and downstream toxicological responses in 2D and 3D HepG2 models

　　

摘要专业翻译 培养形式改变了BPA负荷-反应之间的关系。三维（3D）球体表现出更高的BPA和BPA-硫酸盐（BPA-S）水平，但下游反应减弱。二维（2D）培养中脂质蓄积的发生并未伴随脂肪生成途径的协同诱导。BPA改变自噬加工过程和内溶酶体稳态。2D和3D肝脏模型提供了互补的危害信息。双酚A（BPA）是一种广泛存在的内分泌干扰性环境污染物，与多种不良健康结局相关，包括代谢功能障碍和肝损伤。研究人员在匹配的2D和3D HepG2模型中，将靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）与基于CCK的代谢活性检测、流式细胞术细胞死亡评估、转录组学分析、中性脂质成像以及自噬-溶酶体终点分析相结合，检验了培养形式会改变名义BPA浓度、细胞BPA和BPA-S水平与下游肝脏反应之间关系的假设。急性24小时暴露范围为0.5–100 μM，并以250 μM作为上限挑战条件。结果表明，BPA在两种培养系统中均降低了CCK信号，但3D球体中的降低程度较弱。3D球体中的细胞BPA和BPA-S水平高于2D培养，表明3D反应减弱并非由较低的细胞蓄积所致。常见的BPA响应性转录组特征涉及内质网（ER）应激、自噬-线粒体自噬、线粒体呼吸和细胞周期通路。在2D HepG2细胞中，BPA诱导中性脂质蓄积，但未伴随经典脂肪生成基因的协同诱导。BPA增加了LC3-II和p62的稳态水平，而巴弗洛霉素A1（BafA1）共处理未进一步增加LC3-II，表明溶酶体依赖性清除受损而非自噬起始增强。BPA增加了LAMP1相关的细胞外半乳糖凝集素-3阳性区域，但未显著改变溶酶体酸化指数，提示局灶性内溶酶体膜完整性应激。在3D球体中，尽管LC3-II和p62蓄积，但内溶酶体和中性脂质反应减弱。这些发现揭示了细胞化学负荷与下游毒理学反应之间的模型依赖性解离，支持2D和3D肝脏模型作为互补而非可互换的系统使用。

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研究背景与问题

双酚A（BPA）是一种广泛存在的内分泌干扰性环境污染物，与代谢功能障碍和肝损伤等多种不良健康结局相关。肝脏脂质蓄积和脂肪变性样改变是BPA暴露的反复报告结局，表明脂质稳态是BPA肝毒性的主要靶点。自噬和溶酶体依赖性降解通过脂噬作用清除受损细胞器并参与脂滴周转，对肝脏稳态至关重要。然而，BPA暴露与肝脏脂质处理改变之间的关联机制仍不完全清楚。以往研究多集中于名义浓度-反应关系，而3D模型中观察到的减弱反应可能反映化学物渗透受限、摄取或生物转化改变，或特定细胞负荷下的毒效动力学敏感性差异。区分这些可能性对于2D和3D模型在毒性评估中的序贯使用至关重要，因为相同的名义浓度可能产生不同的细胞负荷和表观模型敏感性。因此，本研究旨在检验培养形式是否改变名义BPA浓度、细胞BPA和BPA-硫酸盐（BPA-S）水平与下游肝脏反应之间的关系，从而产生不同的负荷-反应谱。

研究设计与主要结论

研究人员在匹配的二维（2D）单层和三维（3D）球体HepG2模型中，整合了靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）、CCK代谢活性检测、流式细胞术细胞死亡分析、转录组学分析、中性脂质成像和自噬-溶酶体终点分析。急性24小时暴露范围为0.5–100 μM，以250 μM作为上限挑战条件。研究发现，BPA在两种培养系统中均降低CCK信号，但3D球体中的降低程度较轻。值得注意的是，3D球体中的细胞BPA和BPA-S水平高于2D培养，表明3D反应减弱并非由较低细胞蓄积所致。核心发现是细胞化学负荷与下游毒理学反应之间存在模型依赖性解离。

关键技术方法

本研究采用多项关键技术方法。靶向LC-MS/MS用于定量细胞BPA和BPA-S水平。CCK试剂盒评估代谢活性，Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）流式细胞术检测细胞死亡。QuantSeq 3′ mRNA测序结合edgeR差异表达分析进行转录组学分析，Gene Ontology（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析用于功能注释。中性脂质通过LipidTOX或BODIPY 493/503染色结合荧光显微镜评估。自噬和溶酶体相关蛋白通过免疫印迹检测，LC3、LAMP1和半乳糖凝集素-3通过免疫荧光分析，LysoSensor和LysoTracker染色评估溶酶体酸度。HepG2细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。

研究结果

BPA降低2D和3D肝脏模型中的CCK代谢活性，但3D反应减弱并非由较低细胞BPA负荷解释。 CCK检测显示BPA在两种培养系统中均降低代谢活性，但3D球体中的降低程度较轻。Annexin V/PI流式细胞术显示2D细胞中凋亡和坏死群体增加，但幅度小于CCK信号降低，提示非致死性细胞改变如代谢抑制和增殖变化也参与其中。LC-MS/MS定量显示3D球体中的细胞BPA和BPA-S水平高于2D培养，表明3D反应减弱并非由较低细胞蓄积所致。

常见BPA响应性转录组特征揭示内质网应激、自噬、线粒体自噬、线粒体呼吸和细胞周期通路。 对2D和3D模型中BPA处理后共同改变的基因进行GO和KEGG富集分析。共同上调基因富集于内质网应激、未折叠蛋白反应、自噬体膜相关类别以及蛋白加工、自噬、线粒体自噬、TNF信号、p53信号和凋亡通路。共同下调基因富集于有氧呼吸、氧化磷酸化、线粒体内膜组分和细胞周期、DNA复制及碳代谢通路。

BPA诱导中性脂质蓄积但不伴随脂肪生成基因协同诱导。 LipidTOX染色显示2D HepG2细胞中BPA增加中性脂质沉积。BPA增加脂滴相关基因PLIN2和PLIN3表达，而经典脂肪生成基因FASN、ACACA和SCD保持不变或降低，脂质摄取和甘油三酯合成基因CD36、DGAT1和DGAT2未一致上调。自噬相关基因SQSTM1、MAP1LC3B和ULK1与脂质表型平行增加。

BPA促进LC3-II和p62蓄积而不一致改变mTOR/ULK1磷酸化。 免疫印迹显示BPA浓度依赖性增加LC3-II和p62稳态水平。BafA1处理显著增加LC3-II，而BPA共处理未在BafA1单独水平之上进一步增加LC3-II，表明溶酶体依赖性清除受损是主要贡献因素。p-mTOR/mTOR和p-ULK1/ULK1比值无一致浓度依赖性变化，不支持经典mTOR-ULK1起始信号通路的强激活。

BPA诱导溶酶体完整性应激而不伴随明显溶酶体脱酸。 BafA1显著降低LysoSensor/LysoTracker归一化溶酶体酸度指数，而BPA未显著改变该指数。BPA增加LAMP1相关的细胞外半乳糖凝集素-3阳性区域，改变LAMP1阳性形态，增加LAMP1丰度，降低总半乳糖凝集素-3和LAMP2A。这些结果支持局灶性内溶酶体膜完整性应激而非广泛溶酶体破裂。

3D球体尽管LC3-II和p62蓄积，但内溶酶体和中性脂质反应减弱。 免疫印迹显示BPA增加3D球体中LC3-II和p62丰度。在主要成像数据集中，BPA未显著增加DAPI面积归一化的LAMP1相关半乳糖凝集素-3信号。LAMP1、LAMP2A和总半乳糖凝集素-3蛋白水平维持或升高。LipidTOX和BODIPY染色显示3D球体中无显著中性脂质蓄积增加。脂质输出相关模块分析显示3D球体中脂质输出相关基因模块评分相对维持，而2D细胞在最高浓度下下降。APOC3在2D细胞中随浓度降低，但在3D球体中相对维持。

讨论与结论

本研究通过直接测量细胞BPA和BPA-S水平而非仅依赖名义暴露，揭示了培养形式改变化学负荷与生物反应之间关系的核心发现。CCK信号降低与明显细胞死亡之间的区分表明BPA诱导非致死性功能抑制和代谢应激。BPA诱导的脂质蓄积不伴随脂肪生成基因协同诱导，而是与自噬相关基因平行增加，支持自噬-溶酶体依赖性脂质处理受损的机制。BafA1共处理实验和mTOR/ULK1磷酸化分析支持溶酶体依赖性清除受损而非自噬起始增强。溶酶体数据显示BPA诱导局灶性内溶酶体膜完整性应激而非广泛脱酸。3D球体中较高的细胞BPA和BPA-S水平但减弱的反应表明培养形式改变了负荷-反应关系，3D模型保留了肝相关功能和化学处理能力。脂质输出相关基因的模型依赖性调节提示肝脏脂蛋白处理是3D球体中减弱脂质表型的可能贡献因素，而脂肪酸氧化降低可能是非互斥的补充机制。这些发现支持2D和3D肝脏模型作为互补而非可互换的系统，强调模型选择和内部剂量学在体外肝脏毒性数据解读中的重要性。

研究结论为：BPA在2D HepG2细胞中诱导中性脂质蓄积、损害溶酶体依赖性自噬清除并引起局灶性内溶酶体膜应激。相比之下，3D球体表现出更高的细胞BPA和BPA-S水平，但CCK、中性脂质和内溶酶体反应减弱。培养形式改变了细胞化学负荷与下游毒理学结局之间的关系，支持2D和3D肝脏模型作为互补系统使用，并强调内部剂量学在体外毒性数据解读中的关键作用。