SLC4A9缺陷通过RPS27触发的核糖体应激参与干燥综合征与釉质发育不全的共同发病机制

《Experimental & Molecular Medicine》：SLC4A9 deficiency is involved in Sj?gren’s syndrome and enamel defects through RPS27-triggered ribosomal stress

　　

口干症是一种影响高达30%成年人的唾液腺疾病，通过减少唾液流量和缓冲能力损害口腔稳态。釉质发育不全（amelogenesis imperfecta）是一种遗传性疾病，特征为釉质形成和矿化缺陷，全球儿童患病率介于1/700至1/14,000。尽管口干症已被认为与龋齿易感性增加及随后的釉质损伤相关，但其与釉质发育不全的关系尚不明确，且尚无共享分子通路被因果性地关联到唾液分泌减少和釉质畸形。值得注意的是，几种Cl?/HCO3?交换体调节离子转运和pH稳态，从而影响唾液分泌以及釉质成熟和矿化，这提示这些转运蛋白可能作为口干症和釉质发育不全之间的共同分子连接。在此，研究人员报告了SLC4A9（一种Na+依赖性Cl?/HCO3?交换体）的功能障碍同时破坏了唾液分泌和釉质矿化。遗传学分析鉴定了SLC4A9基因的变异，包括三例釉质发育不全病例中的错义突变以及一例干燥综合征（Sj?gren’s syndrome）患者中伴有SLC4A9表达降低的拷贝数变异（copy number variation）。Slc4a9敲除小鼠表现出双重病理表型，包括分泌减少的唾液功能受损、女性为主的腺体炎症和自身抗体产生，以及伴有成釉细胞分化延迟的釉质畸形。机制上，SLC4A9缺陷破坏了Cl?/pH稳态，导致RPS27上调及核糖体应激（ribosomal stress），进而激活了p53依赖性的细胞周期阻滞和凋亡，同时发生在腺体和釉质谱系中。使用MDM2拮抗剂Nutlin-3a治疗减少了唾液腺炎症，支持了这一通路的治疗潜力。总之，这些发现表明，口干症和釉质发育不全代表了由同一基因变异及共享的核糖体应激相关凋亡机制驱动的重叠表型，尽管发生在不同组织中。这项工作突出了一个统一的诊断靶点以及恢复唾液功能和釉质完整性的潜在治疗策略。

研究背景与问题提出

干燥综合征（Sj?gren’s syndrome, SS）是一种以口干和/或眼干为主要特征的慢性自身免疫性疾病，其发病机制涉及病毒感染、自身反应性T细胞、B细胞过度活化、自身抗体产生及外分泌腺上皮细胞凋亡等多个方面。尽管已有研究报道IRF5、STAT4等基因变异与SS相关，但直接的致病基因仍不明确。另一方面，釉质发育不全（amelogenesis imperfecta, AI）是一类遗传性釉质形成与矿化缺陷疾病，其与口干症的关联长期以来被认为是由唾液分泌减少继发导致的釉质损伤。然而，是否存在共同的分子通路同时调控唾液分泌与釉质矿化，一直是未解之谜。Cl^?/HCO₃^?交换体在维持离子转运和pH稳态中发挥关键作用，而SLC4A9作为Na⁺依赖性Cl^?/HCO₃^?交换体，在小鼠颌下腺（submandibular gland, SMG）和肾脏中高表达，且其缺失会导致唾液分泌部分减少，但其是否直接参与SS或AI的发病尚缺乏证据。基于此，研究人员提出离子转运失衡可能是连接唾液腺功能障碍与釉质缺陷的共同机制，并开展了本研究。该论文发表于《Experimental & Molecular Medicine》。

主要技术方法

研究人员采用了多种关键技术方法：1）从两个中国家系招募了三例AI患者及一例SS患者，采集外周血进行全外显子测序（whole-exome sequencing）或全基因组测序（whole-genome sequencing），并结合Sanger测序验证；2）利用CRISPR/Cas9技术构建了Slc4a9全身敲除小鼠模型；3）采用免疫组化（immunohistochemistry）、免疫荧光（immunofluorescence）和蛋白质印迹（western blot）检测蛋白表达与定位；4）通过微计算机断层扫描（micro-CT）和扫描电子显微镜（scanning electron microscopy）评估釉质结构；5）应用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing）和伪时间轨迹分析（pseudotime trajectory analysis）解析成釉细胞分化路径；6）利用氯离子荧光探针（MQAE）和pH指示剂（BCECF-AM）进行活细胞成像，测量细胞内Cl^?浓度和pH变化。

研究结果

1. 原发性SS患者中SLC4A9水平降低及SLC4A9变异

对5例原发性SS患者和6例非SS口干对照的唇腺标本进行免疫组化分析，结果显示对照组腺泡和导管上皮中SLC4A9呈强阳性，而SS患者中SLC4A9表达显著减弱。全基因组测序在一例SS患者中检测到SLC4A9内含子区的杂合缺失拷贝数变异（copy number variant, CNV），该区域包含两个CCCTC结合因子（CTCF）结合位点，提示CNV可能通过破坏染色质构象导致SLC4A9功能不足。

2. Slc4a9缺陷破坏唾液腺功能、超微结构与黏蛋白稳态

Slc4a9敲除小鼠的颌下腺中SLC4A9表达几乎消失。匹罗卡品刺激后，敲除小鼠的唾液流率显著下降，雌性下降约78.6%，雄性约50%。H&E染色显示导管上皮细胞核固缩、染色质异常分布，腺泡细胞出现空泡化和萎缩。透射电镜观察到分泌颗粒数量减少、体积增大且分布紊乱。PAS染色和转录组分析均显示黏蛋白基因（如Muc6、Muc10、Muc19）表达上调，免疫荧光证实MUC10和MUC3A在敲除小鼠中形成大颗粒状或索状聚集。

3. Slc4a9^?/?小鼠发展出SS样表型

长期观察显示，雌性敲除小鼠在6月龄即出现局灶性淋巴细胞浸润，至10月龄进一步扩大；雄性敲除小鼠至10月龄才出现较轻的浸润。血清学检测表明，雌性敲除小鼠在6月龄起抗核抗体（ANA）、抗SSA/Ro和抗SSB/La抗体水平显著升高，雄性仅抗SSA在10月龄升高。O-糖基化组学分析揭示敲除小鼠唾液腺蛋白发生显著的O-糖基化重塑，涉及ASM3A、HYOU1和DYHC1等免疫调控分子的糖基化位点改变，这些分子富集于先天性和适应性免疫应答通路。

4. Slc4a9^?/?小鼠呈现釉质发育不良

大体观察可见敲除小鼠磨牙尖剥脱、切牙呈粉笔样白垩色且磨损不规则。micro-CT定量显示釉质厚度显著减薄，扫描电镜揭示羟基磷灰石晶体排列紊乱、釉柱多孔且失去正常交织结构。出生后第1天（P1）的组织学切片显示敲除小鼠的磨牙缺乏可辨别的釉质基质，成釉细胞停滞在分泌前状态，无托姆斯突（Tomes’ processes）。

5. Slc4a9缺陷干扰成釉细胞发育与釉质矿化

单细胞RNA测序的伪时间轨迹分析显示，敲除小鼠成釉细胞的分化受阻，前成釉细胞大量积累而分泌期成釉细胞减少。标志物分析表明釉质基质基因（Amelx、Ambn、Enam）在敲除小鼠的分泌期和前成釉细胞中表达受抑，而细胞周期调控分子（Cdk5rap3、Fam19a1）异常持续表达。bulk RNA-seq和蛋白质印迹进一步证实AMELX蛋白表达消失，而牙本质标志物（DSPP、DMP1）不变。原代牙胚细胞矿化诱导后，敲除组的矿化结节形成显著减少。

6. Slc4a9缺失扰乱成釉细胞和唾液细胞的离子转运与pH调控

在原代培养的唾液腺细胞中，敲除小鼠对高氯溶液刺激的Cl^?摄取反应完全丧失，最大摄取速率显著降低。SLC4A2的表达未见代偿性上调。在牙胚细胞中，低氯溶液诱导的Cl^?外排和随之而来的胞内碱化反应在敲除组中均显著减弱，表明SLC4A9缺失损害了Cl^?/HCO₃^?交换活性。

7. Slc4a9缺陷引起的Cl^?转运障碍诱导RPS27表达变化

转录组分析显示核糖体相关分子（包括Rps27）在敲除小鼠的牙胚和唾液腺中差异表达。免疫组化和亚细胞组分蛋白质印迹均证实RPS27在敲除小鼠的胞浆和胞核中表达均升高，且其极性分布被破坏。B23（核仁标记物）免疫荧光显示敲除小鼠唾液腺细胞和牙胚细胞中核仁数量显著减少，提示核糖体生物合成受损并诱发核仁应激。单细胞测序的细胞周期分析揭示前成釉细胞在S期发生阻滞，TUNEL染色证实成釉细胞凋亡增加。

8. Nutlin-3a通过挽救RPS27–MDM2–p53轴恢复Slc4a9^?/?小鼠唾液腺黏蛋白分泌

在敲除小鼠的唾液腺和牙胚中，p53和MDM2在胞浆中显著增多而在胞核中减少，提示胞浆中游离的RPS27可能竞争性结合MDM2，抑制p53的泛素化降解。针对6月龄小鼠给予MDM2拮抗剂Nutlin-3a（20 mg/kg，每48小时一次，持续1个月）治疗后，H&E染色显示敲除小鼠颌下腺的淋巴细胞浸润明显减轻；PAS和PAS-D染色表明，原本在敲除小鼠腺泡中过度积聚的PAS阳性物质（主要为可消化糖原）经Nutlin-3a处理后恢复至接近对照水平。

总结与讨论

本研究表明，SLC4A9缺陷通过破坏Cl^?/pH稳态引发RPS27上调及核糖体应激，进而激活p53依赖的细胞周期阻滞和凋亡，同时影响唾液腺和釉质谱系。这一机制将口干症（干燥综合征的核心表现）与釉质发育不全统一为同一基因变异驱动的重叠表型，而非单纯的继发性损伤。研究结论指出：“这些发现表明，口干症和釉质发育不全代表了由同一基因变异及共享的核糖体应激相关凋亡机制驱动的重叠表型，尽管发生在不同组织中。这项工作突出了一个统一的诊断靶点以及恢复唾液功能和釉质完整性的潜在治疗策略。”