《Cell Proliferation》：Chromatin Modifications Orchestrate DNA Repair Pathway Choice: Epigenetics Strategies for Enhancing CRISPR–Cas9-Mediated Knock-In Efficiency
CRISPR–Cas9介导的精确基因敲入依赖于同源定向修复（HDR），该过程在大多数哺乳动物细胞中频率较低，限制了精确基因编辑在基础研究和治疗应用中的发展。尽管已开发出多种策略以提高敲入效率，但其应用常受限于技术复杂性、适用性有限或潜在安全性问题。本综述提出将研究重心从传统策略转向表观遗传学方法以提高敲入效率。已有证据表明，组蛋白修饰如H3K36me3、H3K9me3、H4K20me2和H2AK15ub参与DNA损伤信号传导以及关键HDR和非同源末端连接（NHEJ）因子的招募。研究人员进一步讨论了通过瞬时染色质调控以偏倚修复途径选择的策略构想，并强调了相关的技术挑战与安全性考量。综上所述，这些发现和见解凸显了组蛋白修饰在塑造染色质状态和协调DNA修复动态中的关键作用。据此，表观遗传调控作为促进高保真基因敲入的有效策略应运而生，为基因编辑的基础研究和治疗转化提供了有价值的机制线索和可行的表观遗传靶点。
主体内容总结
1 引言
基因编辑技术使基因组DNA的精确操作成为可能，可系统探索基因删除、插入、突变和变异，以前所未有的分辨率阐明基因功能。基因编辑技术支持在细胞乃至胚胎水平进行直接遗传操作，极大简化了疾病模型的构建，加速了肿瘤生物学和表观遗传学的研究进展，并为单基因疾病、自身免疫性疾病和癌症开辟了新的治疗途径。在当前的基因编辑平台中，CRISPR–Cas9系统因其简便性、可编程性和可扩展性而成为主导技术。CRISPR–Cas9使用单向导RNA（sgRNA）进行靶向识别，避免了复杂的蛋白质工程需求，并实现了高效的多重靶向和高通量筛选。基因整合策略已从随机逆转录病毒或慢病毒转导发展为基于CRISPR基因组编辑的位点特异性敲入方法。基因敲入技术能够在定义基因组位点精确插入外源DNA，应用广泛，包括通过报告基因或表位标签实时监测基因表达和蛋白质动态、生成疾病相关等位基因用于机制研究，以及通过干细胞或免疫细胞的精确遗传修饰增强细胞治疗。
尽管取得了上述进展，基因敲入的广泛应用仍受限于其固有的低效率。CRISPR–Cas9介导的精确整合主要依赖HDR，该过程在细胞周期的S/G2期最为活跃。相比之下，NHEJ在整个细胞周期中均发挥作用，因此在双链断裂（DSB）修复中占据主导地位，导致精确基因编辑的时间窗口狭窄。当前提高敲入效率的策略主要集中于抑制NHEJ或微同源末端连接（MMEJ）等竞争性修复途径、同步或阻滞细胞于S/G2期，以及对CRISPR–Cas9系统组分进行工程改造。对NHEJ因子的药理学或遗传学抑制可显著提高敲入效率，但持续抑制NHEJ引发了对基因组稳定性和长期安全性的担忧。同样，操纵细胞周期检查点虽可促进HDR，但可能扰乱正常细胞生理。此外，sgRNA工程改造、同源重组供体模板（HDRTs）修饰以及Cas9蛋白工程等广泛优化工作也已被报道可改善敲入效率。
近年积累的证据表明，表观遗传调控的调节，特别是通过组蛋白修饰，提供了提高基因敲入效率的额外策略。例如，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACis）单独使用或与NHEJ抑制剂联合使用可显著提高HDR效率。值得注意的是，DSB处的组蛋白修饰经历高度动态和协调的调控而非孤立变化。随着表观基因组编辑技术的发展，染色质状态的位点特异性操纵已成为可能，提示靶向调节组蛋白修饰可用于改善精确基因编辑。然而，通过组蛋白修饰调控提高CRISPR–Cas9介导基因敲入效率的策略仍未得到充分探索。
2 提高CRISPR–Cas9介导基因敲入效率的现有策略
CRISPR–Cas9系统通过由CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）组成的双RNA复合物发挥作用，该复合物通过碱基配对将Cas9内切核酸酶引导至特定基因组位点。识别前间隔区邻近基序（PAM，DNA序列为NGG）后，Cas9通过其HNH和RuvC核酸酶结构域诱导位点特异性DSB。CRISPR–Cas9产生的DSB随后通过复杂的细胞内DNA修复途径进行修复，主要是易错的末端连接机制或无误的HDR。NHEJ和MMEJ在整个细胞周期中发挥作用，常引入插入或缺失（indels），而HDR通过同源DNA模板实现精确的序列替换或插入。尽管HDR具有精确性，但其本质上效率低下，仅限于细胞周期S/G2期，需要供体模板，且经历多步骤耗时的过程。因此，CRISPR–Cas9介导的HDR效率通常为0.5%至20%，显著低于哺乳动物系统中通常超过20%至70%的NHEJ介导编辑效率。
2.1 优化CRISPR–Cas9系统以提高基因敲入效率
对CRISPR–Cas9系统组分的修饰已被探索用于提高敲入效率，包括sgRNA结构优化、Cas9变体工程和供体DNA模板修饰。修饰的sgRNA可提高Cas9–RNA–DNA复合物的稳定性、增加编辑效率和减少脱靶效应。具有改变DNA结合或切割特性的Cas9变体已被证明可降低脱靶活性。然而，多项研究报道，仅提高核酸酶特异性或活性通常对HDR介导的敲入效率影响甚微。在供体模板设计方面，单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）常被用于提高HDR效率和减少切割位点的非预期整合。在ssODN同源臂中掺入Cas9靶向序列（CTSs）已被报道可将敲入效率提高两倍以上。此外，聚-L-谷氨酸（PGA）等带负电的阴离子聚合物被用于稳定核糖核蛋白（RNP）-供体DNA复合物，防止聚集和沉淀，在维持细胞活力的同时提高敲入效率。然而，相互矛盾的报道表明PGA并非一致地增强HDR结果，凸显了进一步方法优化的必要性。此外，大规模ssDNA生产成本仍高于双链DNA，需要ssDNA合成技术的进步和成本降低。
2.2 调节DNA修复途径以提高基因敲入效率
调节DNA修复途径活性是促进HDR的另一主要策略。抑制NHEJ相关因子，包括Ku70/80、DNA-PKcs、DNA连接酶IV和DNA聚合酶θ，已被证明可将修复结果偏向同源重组。DNA-PKcs小分子抑制剂如NU7026和M3814可提高HDR效率。然而，积累的证据表明，NHEJ途径的全局抑制可能损害基因组完整性。例如，强效DNA-PKcs抑制剂AZD7648在提高基因敲入效率的同时，诱导频繁的千碱基至兆碱基规模的缺失、染色体臂丢失和易位。此类大规模染色体改变难以通过常规基因组编辑检测方法发现。因此，使用AZD7648类抑制剂增强HDR时，需要对多种编辑结果进行全面评估。与此同时，增加HDR相关因子的表达或局部招募也可促进HDR。将Cas9与HDR相关蛋白或功能结构域融合，包括RAD51、RAD52、CtIP、mSA或DN1S，已被证明可显著提高HDR频率。同样，Cas9与选择性招募RAD51的短肽融合可直接促进DSB位点的HDR。然而，确定既能保持Cas9核酸酶活性又避免对内源DNA修复过程产生非预期扰动的融合结构仍具技术挑战。
2.3 调节细胞周期以提高基因敲入效率
细胞周期的调控是提高基因敲入效率的另一常用策略。药理学延长S/G2期可有利于HDR介导的修复并提高精确整合效率。或者，将Cas9与人Geminin的N端区域融合，使该核酸酶成为APC/Cdh1 E3泛素连接酶复合物的底物，导致G1期Cas9表达水平低，在S/G2/M期优先活跃。与野生型Cas9相比，该方法被报道可将HDR效率提高达87%。尽管具有这些优势，细胞周期限制性Cas9策略受限于狭窄的编辑窗口、细胞类型依赖性、潜在脱靶效应、技术复杂性以及对内源DNA修复途径的可能干扰。
3 染色质结构与DNA修复途径选择
近年表观遗传技术的发展揭示了染色质状态与HDR介导DNA修复之间的密切关联。积累的证据表明，组蛋白修饰及其动态调控在DSB后修复途径选择的调控中发挥关键作用。通过调节核小体稳定性、DNA可及性和高阶染色质结构，这些修饰影响修复机制的招募、组装和协调。因此，DSB周围的染色质景观成为修复结果的关键决定因素，能够促进或限制HDR因子。
3.1 组蛋白翻译后修饰协调DSB修复途径选择
在真核细胞中，基因组DNA被包装成染色质。核小体由H2A、H2B、H3和H4组成，包裹约147 bp DNA并由组蛋白H1稳定，提供结构组织并影响DNA损伤识别和修复。染色质分为常染色质和异染色质，二者在压缩程度、转录活性和表观遗传特征上存在差异。DSB诱导后，染色质通过核小体定位、组蛋白变体和翻译后修饰（PTMs）的改变进行动态重塑，最终调控DNA可及性、修复因子招募和修复途径选择。常染色质区域的DSB通常修复更快，可参与NHEJ或HDR，而异染色质断裂表现出延迟修复和染色质依赖性途径偏倚，H3K27me3富集区域倾向于MMEJ，H3K9me3标记结构域显示HDR增加。全基因组研究进一步揭示染色质重塑延伸至DSB周围千碱基区域，表明空间组织的表观遗传反应。除组蛋白修饰外，DNA甲基化也参与DSB反应。损伤后DNMT1被招募至DSB附近，导致5mC沉积，可被TET酶转化为5hmC。5hmC与γH2AX和53BP1共定位，可能支持基因组稳定性。与DNA甲基化相比，组蛋白修饰对DSB修复的影响更为瞬时，因为它们高度动态且可逆。
组蛋白PTMs，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和SUMO化，作为整合DNA损伤感知与染色质重塑和修复因子招募的分子信号。DSB诱导后，DSB处及其周围迅速建立级联组蛋白修饰，创造动态染色质状态。首先，它们通过改变核小体稳定性和高阶染色质折叠来调节染色质可及性。其次，它们为表观遗传阅读器和DNA修复蛋白提供结合平台。第三，它们影响修复复合物的稳定性、滞留和活性，从而偏倚修复途径选择。组蛋白乙酰转移酶（HATs）和去乙酰化酶（HDACs）调节DSB附近的染色质松弛，促进DNA末端切除和增加修复因子的可及性。组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶控制关键修复蛋白（包括CtIP、53BP1和BRCA1）的招募和稳定性，从而影响NHEJ与HDR途径之间的平衡。泛素化和SUMO化级联通过协调染色质重组与DNA损伤检查点激活来强化这些过程。
3.2 与增强HDR相关的组蛋白修饰
特定组蛋白修饰创造有利于HDR的染色质环境。组蛋白H3第36位赖氨酸三甲基化（H3K36me3）是活跃转录常染色质的标志，在促进HDR中发挥关键作用。DSB形成后，含PWWP结构域的蛋白——晶状体上皮衍生生长因子（LEDGF）识别H3K36me3，将CtIP招募至损伤位点，促进DNA末端切除。该过程使复制蛋白A（RPA）和RAD51随后结合，驱动同源重组。值得注意的是，DSB诱导后H3K36me3水平基本保持不变，表明该标记主要作为预先存在的表观遗传信号，许可常染色质区域的HDR。
H3K9三甲基化（H3K9me3）是转录抑制性异染色质的经典标志，长期被认为与DNA可及性降低相关。矛盾的是，积累的证据表明H3K9me3在DSB后促进HDR中发挥必要和积极作用，特别是通过激活ATM-TIP60信号轴。DSB诱导后，组蛋白甲基转移酶SUV39H1迅速被招募至损伤位点，催化局部H3K9me3沉积。该初始成核事件促进KAP1/HP1/SUV39H1复合物的组装，并促进H3K9me3沿断裂侧翼染色质区域扩散。这种损伤诱导的异染色质化作为高效DNA损伤反应激活所需的信号平台。H3K9me3与HDR之间的关键机制联系由TIP60介导，TIP60是一种组蛋白乙酰转移酶。H3K9me3增强TIP60与染色质的相互作用，导致TIP60依赖的组蛋白H4乙酰化和随后的ATM激酶激活。激活的ATM磷酸化下游底物，包括γH2AX和KAP1，从而在后期促进染色质松弛，使末端切除和HDR因子招募得以进行。H3K9me3的缺失损害ATM激活，破坏H4乙酰化动态，导致DSB修复缺陷和基因组不稳定。近期研究进一步鉴定Spindlin1（SPIN1）为通过其Tudor样结构域结合H3K9me3的表观遗传阅读器，促进DSB处TIP60激活。SPIN1依赖的H3K9me3-TIP60相互作用强化促进高效ATM信号传导和HDR，而SPIN1缺陷导致修复动力学延迟和基因组不稳定性增加。
3.3 与增强53BP1介导NHEJ相关的组蛋白修饰
NHEJ与HDR之间的平衡受53BP1招募的关键调控，53BP1是末端连接修复的关键因子。53BP1定位于DSB依赖于对组蛋白H4K20二甲基化（H4K20me2）和H2AK15泛素化（H2AK15ub）的双重识别，形成有利于NHEJ并抑制DNA末端切除的稳定染色质平台。TIP60乙酰转移酶复合物通过多种机制拮抗53BP1介导的NHEJ。TIP60依赖的组蛋白H4乙酰化削弱53BP1与H4K20me2的结合并调节H2AK15泛素化，从而创造有利于BRCA1–BARD1招募和HDR启动的染色质环境。重要的是，TIP60功能受PRMT5调控。在PRMT5缺失时，产生TIP60的剪接变体（TIP60β），该变体无法有效与53BP1竞争染色质结合，导致修复转向NHEJ介导的修复。
4 提高敲入效率的表观遗传调控策略
CRISPR-based表观基因组编辑工具，其中核酸酶失活Cas9（dCas9）与表观遗传修饰因子融合，可实现染色质状态的位点特异性操纵而不改变底层DNA序列。例如，dCas9-DNMT3A和dCas9-TET1系统已被广泛用于探索DNA甲基化和去甲基化在转录抑制和激活中的作用。同样，dCas9与组蛋白修饰酶（如LSD1或组蛋白乙酰转移酶p300）的融合允许在启动子和增强子处靶向去除或沉积组蛋白标记。由于Cas9诱导的DSB在内源染色质环境中产生和修复，断裂位点周围的表观遗传景观关键影响DNA修复因子的招募和活性。基于调控DSB修复途径选择的表观遗传机制，可采用多种策略将Cas9诱导的DNA修复偏向HDR。这些方法可分为三类：（i）调节染色质可及性和组蛋白修饰状态，（ii）靶向招募表观遗传调控因子至Cas9断裂位点，以及（iii）减弱HDR的染色质依赖性屏障，特别是53BP1介导的末端连接。
4.1 调节染色质可及性以提高敲入效率
染色质可及性反映核大分子物理接触染色质化DNA的能力，主要由核小体占据、组蛋白修饰和高阶染色质组织决定。由于CRISPR–Cas9诱导的DSB在天然染色质环境中产生和修复，局部染色质可及性关键影响Cas9结合和切割效率以及下游DNA修复途径选择。可及染色质促进Cas9招募和切割、增强DNA末端切除和促进RAD51等HDR因子的加载，从而将修复偏向HDR，而有限切除条件下的快速KU结合可有利于NHEJ。
HDAC抑制剂（HDACi）是瞬时增加染色质可及性的广泛使用策略。它们促进组蛋白过度乙酰化、染色质解压缩和Cas9靶位点可及性增加。跨多种染色质背景的表观遗传抑制剂高通量筛选显示HDACis部分增强Cas9编辑结果，但其效果强烈依赖局部染色质状态。例如，曲古抑菌素A（TSA）在低基础H3K27ac水平的位点优先增强Cas9编辑效率，而在已乙酰化区域效果较弱。在原代成纤维细胞中，TSA和PCI-24781在GAPDH位点将敲入效率提高约两倍，在ACTB位点提高1.6至2倍。TSA与靶向互补途径的抑制剂联合使用时，原代T细胞CD5位点的敲入效率进一步增加，较对照条件提高134%。丙戊酸（VPA）通过抑制HDAC2活性增加H3K9、H3K27和H4K16的乙酰化，从而松弛转录不活跃位点的核小体结构。在AAVS1位点，VPA处理将HDR效率提高约两倍，甚至使原本难以编辑的HNF4α位点实现纯合编辑。此外，VPA、丁酸钠（NaB）、TSA和辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）等HDAC抑制剂的联合处理进一步提高Cas9和sgRNA表达水平，在开放和闭合染色质区域均改善敲入效率，尽管NHEJ频率也升高。其他HDAC抑制剂包括恩替诺特和替西达林同样增加HDR效率同时降低NHEJ频率。然而，由于HDACis诱导全局组蛋白过度乙酰化而非位点特异性重塑，它们可能增加脱靶编辑和更广泛的表观基因组扰动。
鉴于全局HDAC抑制的局限性，通过CRISPR-based表观基因组编辑探索了Cas9切割位点组蛋白乙酰化的靶向增强。dCas9与转录激活结构域（如VP64）或组蛋白乙酰转移酶（如p300）的融合已成功用于激活基因表达。然而，当这些结构域与具有核酸酶活性的Cas9融合时，观察到对indel形成和HDR的意外抑制作用。特别是Cas9-p300融合显著降低编辑效率，可能由于空间位阻、RNP流动性降低或蛋白质稳定性受损。这些阴性结果表明染色质可及性与DNA修复之间的关系是非线性和高度复杂的。不适当的染色质开放也可能对HDR不利，开放度增加可能促进NHEJ途径激活从而抑制HDR。
4.2 调节组蛋白修饰以将DNA修复偏向HDR
特定组蛋白修饰特征在DSB位点主动指导HDR与NHEJ之间的平衡，独立于全局染色质可及性。H3K36me3是与转录延伸和同源重组相关的成熟染色质标记。AsiSI诱导DSB的全基因组分析表明，发生在H3K36me3富集区域内的断裂优先通过HDR修复。为利用这一特性进行基因编辑，PRDM9被融合至Cas9，能够在通常缺乏这些修饰的切割位点靶向沉积H3K36me3和H3K4me3。PRDM9-Cas9显著提高HDR效率（高达三倍），并将HDR与indel之比提高达五倍，且不增加脱靶编辑。值得注意的是，在已富集H3K36me3的位点增强效果甚微，表明该标记的额外沉积仅在染色质背景中该标记受限时有益。此外，SETD2（哺乳动物细胞中主要的H3K36me3甲基转移酶）与Cas9的融合通过H3K36me3依赖性相互作用招募CtIP来增强HDR效率和促进DNA末端切除。然而，并非所有H3K36甲基转移酶都产生等效效果。例如，SETMAR-Cas9未能促进HDR，可能反映其相对较弱的甲基转移酶活性。
5 调控组蛋白修饰以增强基因敲入效率的潜在概念策略
5.1 基于H3K36me3的增强HDR介导敲入策略
除通过PRDM9或dCas9-SETD2融合系统在靶位点直接沉积H3K36me3外，一个假想的未来方向是通过抑制H3K36me3去甲基化酶来增加H3K36me3水平。KDM4家族，特别是KDM4A和KDM4B，代表潜在靶向策略，因为它们负责H3K36me3和H3K9me3的去甲基化。功能研究为该预测策略提供证据。KDM4B与HDR密切相关，其耗竭损害TIP60和RAD51焦点形成，而KDM4A对HDR的直接作用似乎最小，但对细胞周期进程和复制动态很重要。KDM4A过表达导致S期进展加快、DNA复制和转录加速以及H3K9me3和H3K36me3水平降低。可假设短期抑制KDM4A活性可能创造有利于HDR的染色质环境并潜在增强基因敲入效率。然而，KDM4A的全局抑制可能因该家族广泛的底物特异性和非催化结构域功能而诱导广泛的染色质改变和非预期转录效应。为减轻潜在风险，可考虑假想的位点限制方法。例如，Cas9系连靶向KDM4A JmjC催化结构域的抑制肽可在DSB位点局部减弱去甲基化酶活性。或者，编辑前或编辑期间KDM4A的瞬时siRNA介导敲低可能提供时间控制。
H3K36me3还参与与TIP60介导的H4K16乙酰化的协同染色质网络。可假设增强TIP60在DSB的定位可能增强基于H3K36me3的HDR。TIP60在机制上是比MOF等其他H4K16乙酰转移酶更具吸引力的靶点，后者在DSB修复中的途径特异性作用较小。这导致了新型融合设计的提议，如涉及Cas9与LEDGF或TIP60相互作用结构域的融合，但这些设计是推测性的，需要精确优化以保持酶功能和基因编辑效率。
5.2 基于H3K9me3的增强HDR介导敲入策略
一个纯属推测和非传统的增强HDR策略涉及调节DSB周围H3K9me3的瞬时富集，该标记传统上与基因沉默相关。DNA损伤后，SUV39H1介导的H3K9me3沉积及其通过KAP1/HP1复合物的传播形成激活TIP60和ATM信号传导的局部抑制性染色质结构域。这表明创造瞬时的局部H3K9me3水平可能提高基因敲入效率。将该假设转化为实践仍面临重大挑战。例如，可提议通过Cas9招募SUV39H1催化结构域直接沉积该标记。鉴于SPIN1-H3K9me3-TIP60轴在DNA修复中的最新研究，未来设计可能涉及将SPIN1相互作用结构域系连至Cas9，以稳定H3K9me3识别。然而，此类蛋白质系连策略具有内在风险；即使瞬时升高具有致癌潜力的蛋白质如SPIN1也需要安全性评估。另一种假想方法是使用小分子抑制剂阻断KDM4家族的H3K9me3去甲基化酶。然而，全局抑制可能导致广泛的H3K9过度甲基化、染色质压缩和Cas9可及性降低。此外，持续高H3K9me3水平可能矛盾地阻碍DSB处高效末端切除所需的诱导性H3K9me3激增。因此，需要探索小分子抑制剂浓度和处理时间以调节和平衡常染色质中的H3K9me3修饰水平，并可使用ChIP-seq和ATAC-seq等下一代测序技术检测抑制剂去除后的全局组蛋白修饰水平和染色质可及性。总体而言，增加H3K9me3水平以提高基因敲入效率似乎是双刃剑，可能产生背景依赖甚至相反的结果。
5.3 基于H4K20me2和H2AK15ub的减弱NHEJ和增强HDR介导敲入策略
除促进HDR相关染色质特征外，减弱有利于NHEJ的组蛋白修饰是互补策略。该方法主要靶向关键NHEJ因子53BP1的招募，该因子识别DSB位点的H4K20me2和H2AK15ub。减少这些标记可减弱53BP1积累并将修复转向HDR。H4K20甲基化由KMT5A/B/C顺序催化，抑制这些酶可减少53BP1焦点形成并增加对HDR的依赖。小分子抑制剂如A-196已被证明可抑制NHEJ并促进HDR相关染色质状态，可能通过TIP60介导的H4K20乙酰化替代H4K20me2。然而，A-196在基因编辑中的应用尚未经实验证实。此外，KMT5抑制与γH2AX水平升高相关，提示潜在基因组不稳定性和需要仔细的安全性评估。
另一种更直接的方法是干扰53BP1功能本身。这已通过工程化抑制剂（如i53）、显性负性53BP1变体或竞争性结合伴侣成功实现，阻断其与H4K20me2和H2AK15ub的相互作用。H2AK15泛素化由RNF8-RNF168催化，是53BP1招募的另一关键信号。抑制该途径促进TIP60依赖的乙酰化并将修复从NHEJ转向HDR。此外，一些探索性策略如将Cas9与抑制肽或BRCA1招募结构域（如BARD1片段）偶联可能增加靶位点的HDR，但缺乏实验证据。然而，虽然抑制53BP1招募是提高敲入效率的合理策略，但53BP1在基因组维持中的多效性作用需要谨慎实施。瞬时功能干扰虽然在靶位点可能有益，但可能损害不相关DSB的修复保真度。
5.4 位点特异性表观遗传分析以实现染色质背景基因敲入策略
DSB后DNA修复途径的选择受周围染色质特征影响。在常染色质中，预先存在的组蛋白修饰（包括乙酰化如H3K14ac、H3K27ac、H4K16ac、甲基化和泛素化）以及损伤后诱导的修饰共同影响DNA修复。例如，DSB处预先存在的H4K16ac将促进HDR，而在H3K36me3未预先存在的区域DSB后局部增加H3K36me3可增强HDR。异染色质内的表观遗传背景同样至关重要。H3K27me3标记区域优先使用NHEJ，而H3K9me3标记区域倾向于HDR。因此，当靶向H3K27me3富集的沉默区域时，适应原则涉及瞬时擦除该抑制性标记或在编辑前将局部环境转换为更接近常染色质的状态。然而，当前研究往往缺乏特定靶位点的系统表观遗传景观。因此，有效应用表观遗传调控于精确基因组编辑时，不应仅关注标记一般常染色质或异染色质的组蛋白修饰，而应关注特定位点染色质修饰的复杂调控网络。构建能够预测位点特异性修复结果的全面的高分辨率染色质图谱至关重要。此外，组蛋白修饰在DNA修复中是动态和背景依赖的，需要瞬时的空间限制性表观遗传干预以避免全局染色质破坏。大型Cas9融合蛋白可能损害递送和稳定性，凸显了对极简模块化设计的需求。高通量计算筛选和AI引导优化可降低早期实验复杂性。
6 挑战与未来展望
表观遗传调控是DSB修复途径选择和CRISPR–Cas9介导敲入效率的关键动态决定因素。染色质不是被动底物，而是作为主动参与者协调组蛋白修饰、核小体组织和修复因子招募以影响DNA修复。重要的是，敲入效率不随染色质可及性线性增加；相反，修复结果反映染色质状态、细胞周期和途径竞争之间的协调相互作用。
6.1 挑战
使用小分子抑制剂的全局表观遗传调控仍是快速研究的便捷有效方法。然而，其固有的非特异性可导致转录失调和损害基因组稳定性。作为更具靶向性的替代方案，通过siRNA靶向特定表观遗传修饰因子或染色质重塑因子进行敲低，可对特定类别的修饰提供更精确的控制，从而降低全局扰动的风险。然而，实现位点特异性调控的目标需要更精确的分子工具。CRISPR-based表观基因组编辑系统如Cas9融合蛋白正是为表观遗传调控而设计。然而，其开发固有地具有挑战性。首先，大型表观遗传功能结构域与Cas9的融合增加蛋白质尺寸，对病毒（如AAV）包装和递送构成重大障碍。其次，这些融合蛋白的设计需要在功能效力、最小空间位阻和保持核酸酶保真度之间取得精细平衡。
表观遗传策略的功效高度依赖细胞背景，包括细胞类型和状态。在快速增殖细胞系中验证的干预措施往往无法直接转化至原代或静止细胞。这种差异源于染色质可及性、DNA复制动态和主要DNA修复途径的根本差异。因此，无论涉及小分子、siRNA还是Cas9融合，没有单一策略可预期在所有细胞类型和基因组位点中表现最佳。任何旨在提高基因敲入效率的策略，从全局抑制剂到靶向Cas9系统，都必须通过系统安全性评估进行验证。建立包括核型分析、用于脱靶分析的全基因组测序、用于染色质可及性和相关组蛋白修饰变化的ATAC-seq和ChIP-seq以及转录组分析在内的全面安全性评估指南是临床转化的必要前提。
6.2 未来展望
为克服这些挑战，一个有前景的研究方向是利用染色质分析系统绘制基因组位点的表观遗传景观。此外，AI和机器学习可整合多组学数据与现有功能结构域的性能数据，促进计算机模拟预测和筛选针对特定染色质环境优化的新型融合蛋白，实现个性化和背景依赖的编辑策略。即使通过使用核心功能结构域最小化融合蛋白尺寸，构建体通常仍超过AAV的有限包装容量。这促使探索聚焦于工程化Cas9蛋白本身以获得更紧凑尺寸，或开发具有更大载荷的替代递送平台，如外泌体或脂质纳米颗粒（LNPs）。
表观遗传调控的应用不仅限于提高常规CRISPR–Cas9介导的HDR效率，还与下一代编辑工具具有巨大协同潜力。先导编辑（PE）在不诱导双链断裂的情况下实现了大DNA片段的精确插入，展现出良好的安全性特征和低脱靶效应。在非病毒CAR-T细胞制造中，PE在原代人T细胞中实现了令人印象深刻的整合效率（高达50%），用于3 kb CAR盒的整合且毒性极小。然而，其他研究结果也表明PE效率在不同局部染色质环境中存在差异。例如，可及TRAC位点的敲入效率显著高于更致密的AAVS1位点。这一结果明确凸显了将瞬时表观遗传调控与精确基因编辑器相结合的协同潜力。一个有前景的未来方向涉及瞬时表观遗传调控以创造更许可的染色质环境，并采用PE等高保真编辑器进行高效精确整合。这种组合策略能够在更广泛的基因组位点和细胞类型中实现一致、高效和安全的规模化基因敲入，代表CRISPR介导精确基因组工程的重大创新发展。
