基于聚集诱导发光纳米粒子的双光谱荧光猝灭侧向层析免疫分析用于肉类样品中达氟沙星的高灵敏检测

《Food Frontiers》：Dual-Spectrum Fluorescence Quenching of Aggregation-Induced Emission Nanoparticles for Dual-Signal Lateral Flow Immunoassay of Danofloxacin in Meat Samples

　　

基于传统金纳米粒子的侧向层析免疫分析（AuNPs-LFIA）受限于单一比色信号读出模式及灵敏度不足，严重制约了其在食品安全痕量检测领域的广泛应用。为此，研究人员构建了一种由金纳米粒子（AuNPs）触发双光谱荧光猝灭的侧向层析免疫分析（DSFQ-LFIA），用于肉类样品中达氟沙星（DAN）的比色及荧光双模式检测。以四甲基4′,4?,4?″,4?″″-(乙烯-1,1,2,2-四基)四([1,1′-联苯]-4-甲酸甲酯)（TCBPE）作为聚集诱导发光（AIE）发光原，合成了聚集诱导发光纳米粒子（AIENPs）。所设计的TCBPE分子具有较低的最高占据分子轨道（HOMO）与最低未占分子轨道（LUMO）能隙，展现出显著的AIE效应，赋予AIENPs高达67.2%的荧光量子产率。由于AuNPs的吸收带与AIENPs的激发/发射光谱之间存在显著的双光谱重叠，AuNPs可作为高效的荧光猝灭剂。在无DAN存在时，抗体标记的AuNPs（AuNPs-Ab）与检测线（T线）结合，引发AIENPs的显著荧光猝灭；反之，DAN的存在使AIENPs的荧光基本保持不猝灭状态。DSFQ-LFIA的检出限（LOD）在荧光模式下为0.012 ng mL?1，在比色模式下为0.032 ng mL?1。该方法为食品基质中痕量污染物的快速、灵敏检测提供了一种有效途径。

论文解读

一、研究背景与问题提出

达氟沙星（DAN）作为第三代氟喹诺酮类抗生素的代表，在集约化畜牧养殖和家禽养殖中被广泛用于细菌感染的治疗与管理。然而，其滥用或过量使用常导致动物源性食品中的药物残留以及细菌耐药性问题，对公众健康构成显著风险。依据中国国家标准（GB 31650-2019），DAN在猪肌肉中的最高残留限量设定为100 μg kg^?1，在牛和禽类肌肉中为200 μg kg^?1。因此，开发快速、灵敏的DAN检测方法具有迫切的现实需求。

目前DAN检测的主流分析技术包括高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-串联质谱法（LC–MS/MS）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等，但这些方法受限于仪器成本高昂、样品前处理繁琐、耗时较长以及对专业操作人员的要求，难以满足现场快速检测的需求。相比之下，侧向层析免疫分析（LFIA）凭借操作简便、检测快速和成本低廉等优势，已成为即时检测（POCT）的关键工具。然而，传统基于金纳米粒子（AuNPs）的LFIA存在灵敏度不足和定量能力较差的缺陷，限制了其在痕量检测中的应用。

为克服上述局限，研究人员探索了多种信号放大策略，包括表面化学增强LFIA、金属有机框架（MOF）纳米材料增强LFIA以及全限制型AIE发光原组装增强LFIA等。此外，量子点和有机染料等传统荧光材料虽已被整合到LFIA系统中，但这些材料常受聚集诱导猝灭（ACQ）效应的困扰，在高浓度或聚集状态下发生显著荧光衰减，严重削弱了荧光材料的信号强度，进而损害了LFIA的分析性能。与之相反，聚集诱导发光（AIE）是指AIE发光原在聚集状态下发出明亮荧光的独特光物理现象，主要归因于分子内运动的受限。AIE纳米粒子（AIENPs）凭借增强的发光性能，可作为生物分析中的优异信号探针。然而，大多数AIE发光原固有的疏水性限制了其在水相介质中的溶解性，对它们在生物传感平台中的广泛应用构成了显著障碍。

基于上述背景，本研究旨在构建一种新型的双光谱荧光猝灭LFIA（DSFQ-LFIA）平台，以AIENPs作为信号转导元件、AuNPs作为高效荧光猝灭剂，通过竞争免疫反应与荧光猝灭效应的协同作用，实现肉类样品中DAN的比色和荧光双模式高灵敏检测。

二、研究内容与主要结论

研究人员成功构建了DSFQ-LFIA平台，实现了肉类样品中DAN的快速、灵敏检测。该平台的双信号（比色和荧光）源于高发光AIENPs与高效等离子体AuNPs的协同整合，确保了检测结果的高可靠性。通过将AuNPs的吸收带与AIENPs的激发/发射光谱进行战略性匹配，获得了显著的荧光猝灭效率。DSFQ-LFIA对DAN检测的LOD在荧光模式下低至0.012 ng mL^?1，在比色模式下为0.032 ng mL^?1。除高灵敏度和高可靠性外，所构建的DSFQ-LFIA还表现出较短的检测时间（18 min）、对10种其他类似物无明显的交叉反应，以及在鸡肉、猪肉和牛肉样品中可接受的回收率（70%–125%）。这些结果表明，所开发的DSFQ-LFIA为食品基质中DAN残留检测提供了一种稳健且有前景的替代方案。

三、关键技术方法概述

研究人员主要采用了以下几项关键技术方法：其一，通过微乳液法合成AIENPs，以TCBPE作为发光核心、聚苯乙烯-马来酸酐共聚物（PSMA）作为稳定表面活性剂，赋予纳米粒子优异的水相分散性和高荧光量子产率（67.2%）；其二，采用一锅法合成球形AuNPs，作为高效的荧光猝灭剂；其三，通过静电吸附将抗DAN单克隆抗体标记于AuNPs表面，制备AuNPs-Ab探针；其四，利用BioDot XYZ-3060平台将AIENPs与DAN-牛血清白蛋白（BSA）完全抗原的混合物喷涂于硝酸纤维素（NC）膜上的T线，将山羊抗小鼠IgG喷涂于C线，组装DSFQ-LFIA试纸条；其五，采用竞争免疫反应模式，结合荧光和比色双信号读出进行定量分析。

四、研究结果

4.1 分子工程

研究人员通过分子工程策略优化了AIE发光原的性能。与经典的四苯乙烯（TPE）相比，TCBPE通过引入额外的苯环和甲酸甲酯基团扩展了π电子共轭体系，增强了电子密度分布。密度泛函理论（DFT）计算显示，TCBPE的LUMO-HOMO能隙为3.51 eV，显著低于TPE的4.16 eV，表明TCBPE具有更低的基态到激发态跃迁能垒，赋予其更活跃的物理化学性质。此外，PSMA作为界面表面活性剂，其苯乙烯疏水部分可通过相似相溶原理将AIE发光原封装于微乳液中，而马来酸酐部分则在水相介质中稳定AIENPs并引入丰富的羧基，为后续功能化提供了锚定位点。

4.2 AIENPs表征

通过微乳液法制备的AIENPs表现出优异的荧光性能。荧光光谱显示，AIENPs的激发峰位于369 nm，发射峰位于515 nm，斯托克斯位移达146 nm，有助于减少散射和自发荧光干扰。透射电子显微镜（TEM）图像显示AIENPs的平均粒径为81.9 nm，动态光散射测得水合粒径为107.9 nm，多分散指数（PDI）为0.15。元素分布图证实C、O、S元素在AIENPs内均匀分布，其中S元素的存在直接证明了十二烷基磺酸钠（SDS）成功掺入AIENPs结构。AIENPs在水相中的荧光量子产率达67.2%，较游离TCBPE在氯仿中的1.8%提高了37.3倍，证实了TCBPE分子在AIENPs内处于聚集状态，有效激活了AIE效应。与商业荧光微球（FMs）相比，AIENPs在相同质量浓度下表现出显著更高的荧光强度，其截止浓度为10^?1 μg mL^?1，比FMs低50倍，证明了AIENPs作为高效荧光纳米探针的优越性。

4.3 荧光猝灭

通过一锅法合成的AuNPs在526 nm处呈现特征性的表面等离子体共振（SPR）吸收峰，接近AIENPs的发射峰（515 nm）。此外，AuNPs在300–458 nm范围内的宽吸收带与AIENPs的激发峰（369 nm）重叠，表明AuNPs的吸收光谱与AIENPs的激发和发射光谱均存在显著重叠，有利于实现高荧光猝灭效率。TEM图像显示球形AuNPs的平均粒径为19.6 nm。随着AuNPs体积从0增加至180 μL，AIENPs的荧光强度从43,120 a.u.逐渐降至10,021.67 a.u.，猝灭效率达77%，且过程中未观察到光谱位移。通过Stern–Volmer曲线测得AuNPs对AIENPs的猝灭常数为K_SV。Zeta电位分析显示AuNPs、AIENPs和AIENPs–AuNPs的电位分别为?31.37、?25.40和?16.90 mV，由于负电荷物种间的静电排斥作用，AIENPs与AuNPs之间不存在物理吸附。AIENPs和AIENPs–AuNPs的荧光寿命分别为4.45 ns和4.43 ns，表明引入AuNPs后荧光寿命几乎无变化。结合显著的双光谱重叠特征，研究人员确认内滤效应（IFE）是主要的荧光猝灭机制。

4.4 DSFQ-LFIA传感性能

为最大化DSFQ-LFIA的灵敏度，研究人员在0和1 ng mL^?1 DAN浓度下系统优化了关键参数，确定最佳条件为：0.2 M K₂CO₃溶液体积10 μL（pH调节）、DAN-BSA浓度1 mg mL^?1、抗体质量20 μg、免疫反应时间15 min。随着DAN浓度从0增加至5 ng mL^?1，紫外光下T线的可视化荧光信号逐渐增强，表明荧光信号与DAN浓度呈正相关，这归因于竞争性LFIA与荧光猝灭效应的综合结果；而自然光下T线的比色信号呈下降趋势，与竞争性LFIA的预期行为一致。荧光模式下，标准曲线的回归方程为y = 12,506.63 + 4053.66 × lg x（R² = 0.98），线性范围为0.01–5 ng mL^?1；比色模式下，校准曲线拟合为y = 3877.25–6235.20 × lg x（R² = 0.98），线性范围为0.01–5 ng mL^?1。荧光模式的LOD为0.012 ng mL^?1，较比色模式（0.032 ng mL^?1）提高了2.7倍。低LOD可归因于AuNPs与AIENPs之间IFE的高效荧光猝灭效率，有效抑制了背景信号并提高了信噪比。与HPLC、LC–MS/MS、ELISA和LFIA等已有方法相比，所提出的DSFQ-LFIA展现出更优的灵敏度。特异性实验表明，在1 ng mL^?1浓度下，DAN的荧光和比色信号强度与其10种类似物（MXF、CPFX、NOR、FLX、OBX、ENR、ERY、SSZ、RFX和MNC）存在明显区分，未观察到明显交叉反应。

五、讨论与结论

回收率实验评估了该方法在实际样品中的可靠性。在荧光模式下，鸡肉基质中5、0.25、0.1 ng mL^?1三个加标水平的平均回收率为92%–118%，变异系数（CV）为11%–14%；猪肉中回收率为70%–118%（CV：3%–11%）；牛肉中回收率为70%–98%（CV：7%–11%）。比色模式下，鸡肉中回收率为87%–125%（CV：3%–15%），猪肉中为90%–99%（CV：6%–12%），牛肉中为85%–103%（CV：7%–12%）。这些结果表明所提出的免疫分析方法具有可接受的回收率，证实了其在实际食品样品检测中的可靠性和实用性。

综上所述，本研究成功开发了DSFQ-LFIA平台，用于肉类样品中DAN的快速检测。该平台通过高发光AIENPs与高效等离子体AuNPs的协同整合，实现了比色和荧光双信号读出，确保了检测结果的高可靠性。AuNPs吸收带与AIENPs激发/发射光谱的战略性匹配产生了显著的荧光猝灭效率。DSFQ-LFIA对DAN检测的LOD在荧光模式下低至0.012 ng mL^?1，比色模式下为0.032 ng mL^?1。除高灵敏度和高可靠性外，该平台还表现出短检测时间（18 min）、对10种其他类似物无交叉反应以及在鸡肉、猪肉和牛肉样品中可接受的回收率（70%–125%）。这些结果表明，所开发的DSFQ-LFIA为食品基质中DAN残留检测提供了一种稳健且有前景的替代方案。