《Leukemia》：Mitochondria transfer via tunneling nanotubes drives macrophage immunosuppression and metabolic reprogramming in pediatric AML
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尽管免疫治疗革新了癌症治疗，其在儿童急性髓系白血病（pediatric acute myeloid leukemia, pediatric AML）中的获益仍然有限，部分原因在于对AML微环境的理解尚不完整。虽然多数研究聚焦于T细胞，但对巨噬细胞等先天免疫群体
尽管免疫治疗革新了癌症治疗，其在儿童急性髓系白血病（pediatric acute myeloid leukemia, pediatric AML）中的获益仍然有限，部分原因在于对AML微环境的理解尚不完整。虽然多数研究聚焦于T细胞，但对巨噬细胞等先天免疫群体的探索较少。在儿童AML患者中，研究人员证明免疫抑制性巨噬细胞主导了AML微环境，并支持携带RUNX1::RUNX1T1和KMT2A重排的白血病原始细胞的生长。在共培养实验中，AML细胞将初始型和促炎型巨噬细胞重编程为抗炎状态，其特征为核因子κB（NF-κB）及其他炎症通路的抑制。这一表型转换需要直接的细胞接触，并涉及经隧道纳米管（tunneling nanotubes, TNTs）将AML线粒体转移至巨噬细胞，同时伴随向氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）的代谢重连。功能上，这些被重编程的巨噬细胞表现出吞噬功能受损、传递化疗耐药性，并降低T细胞及双特异性抗体介导的杀伤作用，从而促进免疫逃逸。研究人员的发现揭示了一种新的免疫抑制机制，并提示靶向AML-巨噬细胞相互作用可能增强基于T细胞的免疫疗法的疗效。
一、研究背景与科学问题
儿童急性髓系白血病（pediatric acute myeloid leukemia, pAML）的治疗仍面临严峻挑战，约20%-30%的患儿因治疗相关毒性或复发而死亡。尽管免疫疗法（如免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体T/NK细胞疗法）在其他肿瘤中取得突破，但在AML中疗效有限，原因包括缺乏肿瘤特异性抗原、AML遗传异质性高、化疗后T细胞质量差以及免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）。现有研究多集中于适应性免疫中的T细胞，而对先天性免疫细胞——特别是巨噬细胞——在AML骨髓微环境中的作用认识不足。已有证据表明，成人AML骨髓中的巨噬细胞常呈现抗炎（M2样）表型，可促进白血病细胞存活、抑制T细胞活性并与不良预后相关。然而，儿童AML中巨噬细胞与白血病细胞之间的具体互作机制、这种互作如何导致免疫抑制以及其对化疗和免疫治疗耐药的影响，尚未得到系统阐明。因此，本研究旨在深入探讨儿童AML中巨噬细胞的表型特征、AML细胞如何调控巨噬细胞极化，以及这一过程对治疗效果的影响。
二、研究设计与关键方法
研究人员首先利用两个大型初治儿童AML队列（Maxima队列，n=148；TARGET队列，n=158）及7例非白血病儿童对照的批量RNA测序数据，采用三种免疫解卷积工具（xCell、CIBERSORTx、TIDE）评估巨噬细胞表型。体外实验中，研究人员从健康供者外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中分离CD14+单核细胞，经M-CSF诱导分化为巨噬细胞，再分别极化为M0（未极化）、M1（促炎型）及M2a、M2c、M2d（抗炎型）亚型。随后建立AML细胞（包括细胞系、患者来源异种移植模型PDX及原代AML细胞）与巨噬细胞的共培养体系。关键技术包括：流式细胞术检测表型标志物、免疫荧光与共聚焦显微镜观察隧道纳米管（tunneling nanotubes, TNTs）形成及线粒体转移、Seahorse分析仪测量细胞耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）以评估氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）、以及T细胞杀伤实验评估免疫治疗效能。此外，研究人员还在NGS和NRGS小鼠异种移植模型中验证体内线粒体转移现象。
三、主要研究结果
1. M2样巨噬细胞主导儿童AML骨髓
通过分析两大独立队列，研究人员发现儿童AML骨髓中抗炎型M2样巨噬细胞显著富集，而健康对照组则以促炎型M1样巨噬细胞为主。不同细胞遗传学亚型间存在差异，其中CBFB::MYH11和KMT2A重排AML的M2评分最高。流式细胞术验证了9例患儿骨髓标本，所有AML样本均显示正值的M2/M1比值（均值±标准差：4.3±2.7），而健康对照则为负值（-1.1±0.5）。M2样巨噬细胞丰度与多种免疫检查点分子（TIM-3、LAG-3、PD-L1、VISTA）及“别吃我”信号分子（SIRPα、SIGLEC10）的表达呈正相关。
2. M2样巨噬细胞支持AML增殖，M1样巨噬细胞随时间丧失抗肿瘤活性
共培养实验显示，M2c样巨噬细胞持续促进AML细胞增殖，而M1样巨噬细胞在第3天虽能抑制AML生长，但此效应在第6天消失。细胞周期分析证实，M1共培养在第3天减少了处于S-G2/M期的增殖期AML细胞，但到第6天差异不再显著。在原代AML细胞共培养中，4/5的病例验证了这一模式。
3. AML细胞将M0和M1巨噬细胞重编程为M2样表型
与AML共培养后，M1巨噬细胞的M1标志物（CD80下降2-10倍，HLA-DR下降3-40倍）显著下调，而M2标志物（CD206、CD163上升1.5-8倍）上调。转录水平上，促炎基因（IL1A、IL1B、TNF、CXCL9）表达降低，抗炎和促血管生成基因（ARG2、VEGFA、VEGFC）升高。细胞因子谱显示，促炎介质（IL-1β、IFN-γ、TNF）分泌减少，而抗炎因子（IL-4、IL-10、CCL22、CCL18、可溶性CD163、VEGF）增加。功能上，经AML预处理的M1巨噬细胞吞噬能力显著下降，“别吃我”受体SIRPα和SIGLEC10表达上调。
4. 化疗药物加剧抗炎型巨噬细胞重编程并保护AML细胞免于凋亡
阿糖胞苷（cytarabine, Ara-C）或柔红霉素（daunorubicin, DNR）处理本身即可诱导巨噬细胞CD163上调，而与AML直接共培养时这一效应协同增强。重要的是，只有直接共培养（而非transwell隔离培养）才能保护AML细胞免受化疗诱导的凋亡，表明该保护作用严格依赖细胞间直接接触。
5. AML细胞抑制巨噬细胞炎症通路
批量RNA测序显示，与AML共培养6天后，M1巨噬细胞的转录组向M2样状态转变，表现为NF-κB通路基因（NFKB1、IRF1、TRAF1、IL1B、CXCL8）显著下调。蛋白水平上，NFKB1表达降低了91%。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）进一步确认了炎症反应和NF-κB通路的广泛抑制，以及适应性免疫和T细胞活化相关通路的抑制。
6. AML细胞通过隧道纳米管将线粒体转移至巨噬细胞
Transwell实验表明，M2标志物的诱导需要直接细胞接触。共聚焦显微镜观察到巨噬细胞与AML细胞之间形成TNTs，并通过TNTs实现功能性线粒体从AML向巨噬细胞的单向转移。TMRM染色显示转移的线粒体保持正常膜电位。通过细胞松弛素D、M-Sec抑制剂、机械振荡或Miro1抑制剂阻断TNT形成或线粒体转运，均可阻止M2标志物CD206和CD163的上调。Seahorse分析证实，接受线粒体的巨噬细胞最大呼吸能力和备用呼吸能力增强，且OXPHOS相关基因表达升高，但OXPHOS抑制并不影响重编程过程，提示OXPHOS升高是重编程的结果而非驱动因素。
7. 体内验证AML细胞向小鼠巨噬细胞转移线粒体
在异种移植小鼠模型中，荷瘤小鼠骨髓巨噬细胞（F4/80+）主要表现为M2样表型（高表达CD301和CD206，低表达CD80和MHC-II）。通过物种特异性引物检测线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA），发现小鼠巨噬细胞中含有大量人源mtDNA（较对照升高约100倍），而人源Alu序列（核DNA标志）几乎不可检测，排除了吞噬整细胞的可能。免疫荧光进一步证实人源线粒体存在于小鼠巨噬细胞内。
8. 重编程巨噬细胞削弱T细胞及双特异性T细胞衔接分子介导的杀伤
经AML预处理3天后，M1巨噬细胞即丧失激活T细胞的能力。在T细胞杀伤实验中，M1巨噬细胞原本可增强CD3+T细胞对AML的杀伤及博纳吐单抗（blinatumomab）介导的细胞毒性，但经AML预处理后这一支持效应完全消失。流式和免疫荧光显示，重编程后的M1巨噬细胞TIM-3和LAG-3表达升高。临床相关性分析表明，在30例接受氟妥珠单抗（flotetuzumab, CD3×CD123双特异性抗体）治疗的复发/难治性成人AML患者中，应答者的基线骨髓M2样巨噬细胞丰度显著低于无应答者，且其预测效能（AUC=0.852）优于CD8评分和IFN-γ评分等已知指标。
四、讨论与结论总结
本研究表明，儿童AML骨髓中富含M2样抗炎巨噬细胞，其丰度与免疫抑制因子表达及白血病增殖正相关。机制上，AML细胞通过双重途径重塑巨噬细胞：可溶性因子主要负责下调M1促炎程序，而通过TNT介导的功能性线粒体转移则是驱动M2样完全极化的必要条件。这一过程伴随NF-κB通路抑制、OXPHOS代谢重编程以及吞噬功能和T细胞支持能力的丧失。化疗药物本身会加剧这一重编程过程，而被重编程的巨噬细胞反过来保护白血病细胞免受化疗和T细胞免疫治疗的杀伤。临床上，高M2样巨噬细胞丰度预示双特异性抗体治疗效果不佳。研究人员的发现揭示了AML免疫逃逸的新机制，并提出靶向AML-巨噬细胞间的TNT通讯或线粒体转移（如通过Miro1抑制剂）可作为增强传统化疗和T细胞免疫疗法疗效的潜在策略。
