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目的：皮质发育畸形（MCD）和低级别癫痫相关肿瘤（LEAT）常引起药物难治性病灶性局灶性癫痫（LFE），适合手术治疗。对切除脑组织进行基因检测可提供诊断和机制信息，并可能最终支持个体化治疗。然而，尚未评估对大体癫痫源性病变进行系统性>300×全基因组测序（GS
目的：皮质发育畸形（MCD）和低级别癫痫相关肿瘤（LEAT）常引起药物难治性病灶性局灶性癫痫（LFE），适合手术治疗。对切除脑组织进行基因检测可提供诊断和机制信息，并可能最终支持个体化治疗。然而，尚未评估对大体癫痫源性病变进行系统性>300×全基因组测序（GS），尤其是在深度外显子组测序（ES）和基于微阵列的基因分型无诊断结果后。
方法：在此，研究人员对来自LFE个体的33个癫痫源性脑病变进行了深度GS（>300×覆盖度），选择具有高遗传发现先验概率的病变，这些个体在既往深度ES（>350×覆盖度）和基于微阵列的基因分型中，候选生殖系或体细胞变异均为阴性结果。
结果：研究人员在33名参与者中的7名（21%）中识别出已知LFE相关基因中的候选体细胞变异。两名参与者各有2个候选变异。总共，33名参与者中的3名（9%）具有只能通过GS检测的变异：TSC2中两个缺失、NPRL3中两个缺失，以及FGFR1中一个外显子倒位。三名个体具有生殖系多态性，可能代表调节因子或风险因素。探索性突变特征分析揭示了时钟样特征，以及突变特征、癫痫发作年龄和组织病理学之间的相关性，提示年龄相关突变机制。
意义：深度GS确立了在全基因组范围内对低变异等位基因频率（VAF）嵌合相关深度进行谱分析的可行性，并揭示ES遗漏的候选变异，尤其是复杂结构变异。随着测序成本降低，GS可能在体细胞变异检测中补充其他技术，使组织测序在癫痫手术中更广泛地临床实施。需要进一步研究以解决体细胞变异检测中剩余的概念性和技术性挑战。
研究背景：癫痫影响约340万美国人（1.2%人口），其中>30%在最佳药物治疗下仍有癫痫发作。病灶性局灶性癫痫（lesional focal epilepsy, LFE）中治疗失败尤为常见，可达50%，其病因是癫痫源性脑病变，包括皮质发育畸形（malformations of cortical development, MCD）和低级别癫痫相关肿瘤（low-grade epilepsy-associated tumors, LEAT），这些病变可能适合癫痫手术。手术结局受潜在遗传病因影响。对切除脑组织进行遗传检测可提高组织病理学准确性、提供术后预后信息并可能支持精准治疗。目前，LFE已与20多个基因的脑特异性体细胞变异相关，但约65%（15%–85%）病例仍未解决，部分与技术限制有关，panel测序为当前标准。近期研究使用外显子组测序（exome sequencing, ES）改善检测，但ES相比全基因组测序（whole genome sequencing, GS）存在两个关键技术限制：一是GS的测序质量通常更高，真阳性变异更多、假阳性更少；二是ES不能捕获全部遗传变异谱，包括结构变异（structural variants, SVs）、大缺失、非编码单核苷酸多态性（SNPs）或插入缺失（indels），而这些在LFE中占较大比例。GS在生殖系疾病中可识别ES后仍未诊断的个体。对大体癫痫源性脑组织系统应用深度GS，尤其是在非诊断性深度ES和基于微阵列的基因分型后，仍未充分探索。>300×覆盖将深度测序扩展至全基因组，产生比常规约30×研究GS多约一个数量级的数据，这对可靠检测低变异等位基因频率（variant allelic frequency, VAF）体细胞嵌合至关重要。因此，研究人员旨在评估在既往非诊断性深度ES（>350×）和基于微阵列的基因分型后，用深度GS（>300×）检测脑组织体细胞变异的综合方法。主要目标是证明可行性，并揭示体细胞变异检测中持续存在的技术和概念挑战。研究人员报告“候选变异”，但不声称诊断率。
关键技术与方法：研究方案经Cleveland Clinic Epilepsy Center机构审查委员会（institutional review boards, IRBs；ID 20–151）和University of Erlangen, Germany（ID 193_18B）批准。33名LFE参与者来自European Epilepsy Brain Bank。入选高遗传诊断概率病变：局灶性皮质发育不良IIB型（focal cortical dysplasia type IIB, FCD IIB）、胚胎发育不良性神经上皮肿瘤（dysembryoplastic neuroepithelial tumor, DNET）、节细胞胶质瘤（ganglioglioma, GG）或MOGHE（mild malformation of cortical development with oligodendroglial hyperplasia in epilepsy，癫痫伴少突胶质细胞增生的轻度皮质发育畸形）。所有样本既往深度ES（>350×）和Illumina OmniExpress SNP arrays阴性。研究人员从新鲜冷冻大体脑组织重复提取DNA，进行>300× GS；用定制in-house计算流程检测生殖系和体细胞单核苷酸变异（single nucleotide variants, SNVs）与SVs；候选变异经独立组织病理复核和多学科小组审查。体细胞SNV用DeepMosaic后call质控，用SigProfiler进行COSMIC SBS96、ID83和SV突变特征分解，用Katdetectr R包无监督变点分析检测局部超突变（kataegis）。
研究结果：
3.1 来自33例切除的癫痫源性人脑病变的深度GS。研究对33例病变（MCD n=24；LEAT n=9）进行深度GS，来自21名（64%）男性和12名（36%）女性参与者。参与者癫痫发作和手术年龄较早：中位发作年龄4岁（IQR 2–7岁，范围0–28岁），中位手术年龄16岁（IQR 8–26岁，范围0.3–45岁），中位随访2年（IQR 24–24个月，范围6–228个月）。术后无癫痫发作结局良好：Engel I为30/33（91%），Engel I–II为32/33（97%）。每名参与者此前均接受非诊断性深度ES和基于微阵列的基因分型。深度GS平均每目标深度294×（SD 39×），在全局、外显子水平和目标水平覆盖上优于ES。研究人员在7/33（21%）MCD或LEAT个体中识别出已知LFE相关基因的候选体细胞变异。两名参与者各有2个候选变异。3/33（9%）具有只能由GS检测的变异：TSC2两个缺失、NPRL3两个缺失和FGFR1一个外显子倒位。共发现2个已知和7个新候选体细胞变异。所有新变异在人群数据库gnomAD、gnomAD-SV、TOPMed、DiscovEHR、UKBB和体细胞变异数据库COSMIC中缺失。一例GG携带BRAF V600E，为已确立致癌变异。RHEB双联变异c.(A104T, C105A):p.Y35L曾在另一FCD II病例中描述，并显示强激活mTOR信号。一例MOGHE携带SLC35A2新错义变异，计算机预测有害（REVEL .912；AlphaMissense .996），此前同一位置类似变异G178I有实验证据显示膜运输丧失。两个NPRL3缺失因高基因组约束（JARVIS score > .9998，99th percentile）和NPRL3 5′ UTR已知功能相关性被保留为候选。FGFR1外显子倒位预计位于激酶域（断点约p.Leu557和p.Arg576），该区域高度约束（全外显子范围错义耐受比，第1百分位），且在DNET中有已知生物学相关性。研究人员在Integrative Genomics Viewer中检查所有候选变异以评估定位质量和链偏倚，并检查深度ES的BAM文件。TSC2 p.L204Afs*30在样本156409的FCD IIB中见于ES数据但未被call，可能因低VAF（4/353，.01）；其他变异在ES数据中缺失。未检测到候选生殖系SNV或SV。样本156415为FCD IIB且带TSC2候选体细胞变异，是相关基因TSC1（rs1073123）和PTEN（rs12573787）两个常见多态性杂合子；样本156393和156413分别携带其中一个。重复组织病理评估确认每例初始诊断，病理与预期遗传病因匹配，支持遗传结果。
3.2 突变特征和变点检测的探索性分析。研究人员探索深度GS能否提供额外生物学见解。用DeepMosaic额外后call体细胞变异质控后，基于COSMIC分解溶液用SigProfiler suite分配突变特征。在79个COSMICv3.3 SBS特征中，每个样本携带两个时钟样单碱基替换突变特征（SBS：SBS1、SBS5），一般指示与患者年龄相关的内源性突变过程。indel特征也呈同样时钟样行为，而SV特征普遍且非特异。样本水平分配统计见表S2–S4，肿瘤突变负荷图见图S7A。SBS1而非SBS5与癫痫发作年龄相关。未发现外源性诱变过程或DNA修复缺陷相关模式，这些在其他癌症中常见。总突变负荷在手术结局不利与有利病例间无差异。对于SBS1而非SBS5，LEAT比MCD有更高突变特征负荷（SBS1：中位数 .646，IQR 1.720 vs 中位数 ?.467，IQR .400；Wilcoxon非配对双样本检验，W=32.5，p=.0024；SBS5：中位数 .428，IQR .568 vs 中位数 ?.399，IQR 1.120；W=79.5，p=.258）。与其他突变特征缺乏关联提示该效应并非简单基于总突变负荷。需在更大独立队列验证。最后，研究人员用无监督变点分析调查局部超突变与体细胞基因组重排共定位的kataegis，未产生任何推定病灶。因此，未发现超突变现象或大规模体细胞基因组重排证据。
讨论总结：4.1 深度GS在ES和阵列阴性LFE病例中识别候选变异。研究人员表明深度GS可检测LFE个体的候选体细胞变异。即使所有参与者既往接受深度ES和阵列分型，候选变异产量仍达7/33（21%），与近期分析未测序组织的研究相当。两名个体各有2个候选变异，此前研究也观察到该现象。由于缺乏全面体细胞变异致病性分类指南，其各自对表型的贡献无法完全解决，不同机制仍可能，如双病因或表型调节。3/33（9%）样本有GS特异变异，突出深度GS优于不全面技术。由于该产量基于已建立LFE相关基因计算，仅代表全面全基因组方法的初始下限。这些发现与生殖系变异研究中GS在非诊断ES后产量（7/125，5.6%）和其他罕见遗传病（9%–60%）一致，但低于癌症测序研究（GS vs ES：89% vs 62%）。研究人员识别出低（<10%）和超低（<2%）VAF变异，符合先前证据。因此，本研究不应解释为标准覆盖GS与ES的常规比较；技术进展在于将>300×测序扩展至大体病变组织全基因组，此深度是可靠检测低水平体细胞变异所需，而这是LFE主要已确立遗传机制。深度GS在此场景有优势，但>300×覆盖产生比常规约30×研究GS多约10倍序列数据，目前每样本约US$10?000。这种资源强度促使近期研究替代方法，包括荧光激活细胞分选和全基因组扩增进行目标富集以提高VAF，以及RNA测序检测体细胞结构变异和基因融合。目标富集可行但技术挑战大，可能不适合大规模基因发现或未来临床应用。RNA测序需先进一步GS研究以更清楚描述LFE结构变异基因组景观。这些方法均有潜在益处：通过体细胞变异检测，可推进对神经发育疾病机制的理解、指导组织病理诊断并指导精准治疗。目前，切除组织体细胞变异检测主要具诊断价值和机制兴趣，对治疗选择或术后管理的直接作用有限，需前瞻性研究。随着测序成本降低，深度GS可能补充或扩展现有体细胞变异检测技术，促进癫痫手术患者组织测序的临床实施。有趣的是，三例样本发现常见生殖系多态性。这些多态性本身不是候选变异，但可能代表调节因子或风险因素。rs1073123（TSC1）和rs12573787（PTEN）此前与特定癌症遗传风险和化疗后无进展生存可能性相关。其在LFE中的作用待澄清，研究人员假设常见变异可能以类似生殖系单基因癫痫综合征和其他神经发育障碍的方式影响疾病风险和表型。进一步探索分析发现时钟样突变特征证据，并与组织病理（LEAT vs MCD）和癫痫发作年龄相关，符合随年龄积累的DNA损伤与修复相互作用。这些临床相关性最终可能提供临床信息信号，例如报告和分子估计的疾病发作年龄不匹配（术后预后关键信息），或报告组织病理与分子谱不匹配，可能促使重新评估。重要的是，非恶性神经疾病中突变特征概念尚未建立，需独立队列验证。更大随访研究可能达到从头突变特征提取所需效力。
4.2 局限。研究人员有意选择高先验概率遗传病因病变，可能引入选择偏倚，深度GS额外产量估计可能不适用其他不特异癫痫源性病变（如FCD I或III）。深度GS从大体组织需要相对大量基因组DNA，因此无法从发现队列既往ES同一DNA进行GS，因为衍生材料已耗尽，而必须重复DNA提取。重复DNA提取可能贡献部分候选变异额外产量，并混淆直接平台比较。因回顾性生物样本库设计，无配对血液样本，所有分析基于未配对脑样本。因此不能完全排除生殖系变异错误分类，不能评论多组织与脑特异性变异分布，或扩展较低可信VAF阈值以包括潜在疾病相关超低频变异。实验验证（如微滴数字聚合酶链反应）会增强研究，但因回顾性设计和样本使用监管限制不可行。研究人员通过视觉分析所有候选变异、使用高级后call质控算法（DeepMosaic）和独立组织病理生物学证据（仅考虑符合已知基因型–表型相关性的变异）降低测序伪影风险，但承认配对样本更稳健。尤其区分生殖系变异依赖来自未使用GS的测序研究的可信区间VAF截断值。仅病变样本不能区分广泛传播与脑特异性体细胞事件。复杂结构变异解读仍有挑战。因此研究人员报告覆盖已知LFE基因的高置信结构变异。未来研究可受益于前瞻性招募配对样本和DNA生物样本库此外组织储存，促进再分析和验证。GS体细胞变异检测产量可能随更多LFE基因–疾病关联发现继续增加。
研究结论翻译：深度GS可能补充或扩展从大体脑组织进行体细胞变异检测的现有技术，同时为未来癫痫手术中的组织测序研究建立技术基准。充分实现该诊断方法的潜力将取决于降低测序成本，因为深度GS目前对广泛临床实施而言过于昂贵。必须仔细考虑这一成本，因为体细胞变异检测的潜在临床益处尚待进一步研究，并且需要成本效益研究。该方法的可及性将取决于包括国家报销结构在内的多个利益相关者，如同标准深度GS用于生殖系疾病一样，并可能在低收入和中等收入国家加剧基因组检测不平等。准确且标准化的体细胞变异解读需要继续努力制定变异分类指南。
