HelD（HelR）作为通用转录因子增强快速生长分枝杆菌基因表达并介导利福平耐药

《Microbiological Research》：HelD is a Global Transcription Factor Enhancing Gene Expression in Rapidly Growing Mycobacteria

HelD蛋白，也称为HelR（在Mycobacterium smegmatis中由MSMEG_2174编码），与分枝杆菌RNA聚合酶（RNA polymerase，RNAP）相互作用，并影响Mycobacterium abscessus的利福平耐药性。在此，研究人员提供了关于其他临床相关非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）基因组中利福平耐药性和helD存在情况的数据。研究人员显示，helD主要存在于快速生长分枝杆菌中，例如M. smegmatis；在该菌中，研究人员在也可与CarD和RbpA结合的启动子亚群处检测到HelD。对helD缺失株的转录组分析揭示，HelD在基因调控中具有双重作用：其在指数生长期增强转录，但在稳定期降低转录。研究人员显示，稳定期转录下调伴随转录起始因子RbpA和CarD数量减少。此外，研究人员利用天然冷冻电镜（cryo-electron microscopy，cryo-EM）表征了含HelD的RNAP复合物。基于这些数据，研究人员提出，HelD作为通用转录因子（general transcription factor），释放停滞的RNAP复合物并使RNAP从启动子解离。HelD展示了一种单一蛋白如何执行根本不同的任务，既介导抗生素耐药，又实现高效转录，从而塑造细菌适应性。

细菌转录是细菌生长和存活所必需的过程。RNA聚合酶（RNA polymerase，RNAP）核心酶由β、β′、ω和两个α亚基组成，并与σ因子结合以识别启动子并起始转录。分枝杆菌RNAP还可结合通用转录因子CarD和RbpA，二者在转录起始中稳定开放启动子复合物（open promoter complex，RPo）。HelD最初在Bacillus subtilis中发现，后在Mycobacterium smegmatis（MSMEG_2174）中发现；其在Mycobacterium abscessus和Streptomyces venezuelae中因参与利福平耐药而被称为HelR。HelD属于解旋酶超家族1（superfamily 1，SF1），可水解ATP和GTP，但缺乏DNA结合结构域，也未检测到解旋酶活性。既往研究显示HelD与多种细菌RNAP结合并使RNAP从DNA释放，推测其促进转录终止后RNAP回收、拆解停滞延伸复合物并抑制RNAP非特异性结合DNA。HelD-RNAP结构提示其N端结构域插入RNAP次级通道，HelD特异结构域进入RNAP初级通道，迫使DNA和RNA离开RNAP，因而HelD-RNAP复合物曾被认为与活跃转录不相容；但近期cryo-EM解析了HelD-RNAP-RbpA-σA复合物。HelD功能多来自体外实验，且结果依赖HelD与RNAP比例，而细菌体内HelD:RNAP比例未知，HelD在体内的作用尚不清楚，也缺乏系统分析。利福平抑制细菌RNAP，用于结核病及部分非结核分枝杆菌感染，但非结核分枝杆菌利福平耐药机制仍多不明确。HelD可在M. abscessus和M. smegmatis中赋予利福平耐药，且其表达受利福平诱导。因此，研究人员分析临床分离株中利福平耐药与helD存在的关系，并在M. smegmatis中研究HelD的体内转录调控作用、结合位点、蛋白丰度及天然复合物结构。

为开展研究，研究人员分析了超过1,400例临床分离株（涵盖15种分枝杆菌）以及超过4,200例M. tuberculosis临床分离株，比较利福平耐药性与helD或arr基因存在情况；使用M. smegmatis mc²155野生型、ΔhelD、ΔhelD+helD及FLAG标签株。关键方法包括RNA-seq并结合RNA spike-in、ChIP-seq、western blot蛋白定量、甘油梯度超速离心、体外RNAP释放实验、天然cryo-EM单颗粒分析、β-半乳糖苷酶启动子活性检测，以及基于NCBI RefSeq基因组和HMMER的系统发育与同源物分析。

研究结果如下。17.1 Nontuberculous mycobacteria differ significantly in their sensitivity to rifampicin：研究人员测试超过1,400例临床分离株，发现几乎全部M. abscessus、M. fortuitum和M. chelonae分离株在50 μg/ml利福平下仍可生长，且均携带helD；M. avium也耐药但不携带helD；多数M. gordonae不生长但携带helD。helD存在与50 μg/ml耐药相关（odds ratio 33；95% CI 2.5–715；p=0.01），20 μg/ml时odds ratio 18（95% CI 0.7–578；p=0.07）；arr数据不确定。结论是helD或arr只能部分解释分枝杆菌利福平敏感性差异，提示还有其他基因或因子参与。

18 HelD is found in the majority of rapidly growing mycobacteria：通过系统发育和同源物分析，研究人员发现近90%被调查的快速生长分枝杆菌具有HelD同源物，而多数慢生长分枝杆菌缺乏HelD同源物；三种快速生长致病菌M. abscessus、M. fortuitum和M. chelonae均携带helD，而M. tuberculosis和M. avium等慢生长菌缺乏。结论是HelD在快速生长分枝杆菌中更普遍，可能与这些菌对活跃转录需求较高相关。

19 HelD is a global transcription regulator：研究人员构建M. smegmatis ΔhelD株并进行指数期和稳定期RNA-seq，加入RNA spike-in。ΔhelD株在指数期全局基因表达下降，在稳定期全局表达上升。DESeq2仅鉴定出指数期2个、稳定期9个显著差异基因，其中稳定期rpoC下降。RT-qPCR验证Ms1、rpoB和sigA在指数期下降；稳定期6个管家基因中4个上升；ΔhelD+helD可挽救稳定期表型，但指数期因HelD水平约为野生型2倍而使表达进一步下降。β-半乳糖苷酶实验显示ΔhelD中rpoB-rpoC和rrnB启动子活性下降。结论是HelD直接影?转录起始，是全局基因表达调节因子。

20 HelD associates with RNAP involved in transcription in vivo：通过HelD-FLAG ChIP-seq，研究人员在指数期检测到114个显著峰（-log₁₀q-value>40），主要位于高表达基因，包括rRNA操纵子、tRNA、RNAP亚基基因和核糖体蛋白基因。HelD峰与RNAP、σA/σB、RbpA-FLAG和CarD-FLAG峰大量重叠，仅2个HelD峰不与这些峰重叠；HelD信号主要与更强的RNAP和σA/σB信号重叠。结论是HelD在体内主要与高表达、RNAP占据基因的启动子区域结合，可能由RNAP和/或σA/σB招募。

21 HelD can release RNAP from transcription initiation complexes：研究人员组装含RNAP、σA和生物素化启动子DNA的开放启动子复合物并结合于链霉亲和素磁珠，加入HelD后部分RNAP从复合物释放。结论是HelD能够拆解转录起始复合物，可能通过清除停滞RNAP增加启动子可用性，从而在指数期增强转录。

22 HelD is abundant protein in M. smegmatis：研究人员制备抗体并用western blot定量。指数期1 μg裂解液含115 fmol RNAP和18 fmol HelD，RNAP:HelD约6:1；稳定期约4:1；HelD-FLAG过表达株中HelD:RNAP约1:1。稳定期RNAP水平不变，HelD部分增加，CarD下降约10倍，RbpA下降约4倍。指数期HelD、RbpA、CarD与RNAP比例相近，稳定期CarD和RbpA相对RNAP显著减少。

22.1 In stationary phase, CarD and RbpA levels decreased, while HelD increased：甘油梯度超速离心显示RNAP复合物主要位于第7至13组分，CarD主要位于第1至6组分，表明多数CarD不与RNAP结合；HelD在指数期主要与RNAP共沉降，RbpA几乎全部与RNAP共沉降。CarD-FLAG免疫沉淀未检出HelD，而RbpA-FLAG免疫沉淀检出HelD；CarD和HelD可结合同一启动子，但不在同一RNAP复合物中。结论是CarD与RNAP结合短暂且可能为限制性调节因子，CarD和HelD可能顺序作用于转录起始。

23 HelD complexes and structure in vivo by native cryo-EM：研究人员从稳定期细胞中经FLAG标签免疫沉淀RNAP并进行天然cryo-EM单颗粒分析，鉴定出HelD-σA-RbpA-RNAP State I（4.18 ?）和State II（4.54 ?），以及DNA-σA-RbpA-RNAP开放启动子复合物。HelD复合物与既往体外结构相符，未在HelD复合物中检测到DNA，也未在任何复合物中检测到CarD密度。结论是HelD在体内是转录起始感受态复合物的组成部分，且与CarD结合互斥或受CarD低丰度限制。

讨论部分总结：研究人员提出HelD直接参与全局转录调控，与启动子相互作用，并与RbpA和σA形成复合物。HelD可在体外从RNAP-σA-DNA开放启动子复合物中释放RNAP，支持其救援停滞转录复合物的模型。指数期HelD主要与高表达基因启动子结合，ΔhelD中表达下降，研究人员提出HelD有助于保持启动子对大量RNAP的可及性；但ΔhelD+helD中HelD水平过高会进一步降低指数期表达，说明HelD活性依赖HelD:RNAP比例和启动子强度。稳定期CarD和RbpA下降，RPo形成减慢，RNAP更易被HelD介导从启动子释放，可解释ΔhelD稳定期全局表达增加。基于HelD:RNAP比例，HelD不足以隔离超过指数期15%、稳定期25%的RNAP，因此不像主要RNAP储存因子。helD存在与利福平耐药部分相关，但M. avium缺乏helD和arr仍耐药，提示其他耐药机制如外排泵。研究结论翻译：研究人员已经表明，即使没有利福平，M. smegmatis细胞也从HelD中获益，尤其是通过其在高度表达基因转录中的作用。helD基因在许多慢生长分枝杆菌中缺失，而在许多快速生长分枝杆菌中存在，这与这些物种更高的转录速率相关。因此，研究人员提出，HelD在快速生长分枝杆菌中作为转录调节蛋白，此外还具有已确立的利福平耐药作用。具有这种多功能作用的蛋白应在未来细菌抗生素耐药机制研究中被仔细考虑。尽管HelD对生存并非必需，但其在转录调控和利福平耐药中的作用使其成为分枝杆菌生理学中的相关因子。因此，靶向HelD可能不会单独消除非结核分枝杆菌，但可能使其对现有抗生素敏感。