《Journal of Cellular Physiology》：Rev-erb-α in Skeletal Muscle Adaptation: Integrating Circadian Control Mechanisms and Exercise Dynamic Responses
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昼夜节律以时间依赖的方式 orchestrate 多种生物过程，以维持机体对运动的稳态响应。在这一框架内，Rev-erb-α作为一种胞内核受体和转录调控因子，超越了其在昼夜节律中的角色，驱动肌生成（myogenesis）、肌肉重塑、初级代谢和自噬
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昼夜节律以时间依赖的方式 orchestrate 多种生物过程，以维持机体对运动的稳态响应。在这一框架内，Rev-erb-α作为一种胞内核受体和转录调控因子，超越了其在昼夜节律中的角色，驱动肌生成（myogenesis）、肌肉重塑、初级代谢和自噬，凸显了其多效性（pleiotropic）作用。本综述整合了来自细胞培养、基因修饰动物模型、药物干预及人类研究的实验证据，重点阐述了Rev-erb-α在骨骼肌和运动适应中的机制作用。最新前沿数据表明，急性运动和慢性运动可引发不同的Rev-erb-α表达特征（signature）。存在双峰调控（bimodal regulation）：运动后即刻Rev-erb-α表达下调，随后升高，反映了其在通路抑制中的首要作用。在慢性条件下，Rev-erb-α的上调可作为一种适应机制，主导对能量需求和线粒体功能的稳健响应，从而协调代谢网络、钙稳态和氧化能力。此外，Rev-erb-α过表达或其药理学激活可减少与肌肉萎缩相关的通路，从而维持组织功能和肌肉质量。令人振奋的是，较高的体力活动水平可增加Rev-erb-α在24小时内的振幅（amplitude），从而增强健康和运动表现。然而，运动时机决定了Rev-erb-α的表达特征，进而影响骨骼肌中的下游表型。因此，阐明Rev-erb-α蛋白的调控和作用机制，可能为在不同健康状况和疾病中改善或维持肌肉质量提供新视角。
论文主体内容总结
1 引言
昼夜节律是内在的24小时周期，在时间上组织行为和生理过程，从而促进稳态和适应性反应。由分布于机体各处的细胞时钟所调控，这些节律通过预适应大脑及其他外周组织（包括骨骼肌）来调节哺乳动物的适应能力。视网膜中的受体对光:暗周期敏感，并将信息传递至视交叉上核（SCN），后者调节相位设定，进而影响睡眠、血压、体温、激素水平和全身代谢等多种生物学功能。骨骼肌中已鉴定出时钟基因组机制，显示超过1000个基因呈现节律性表达。在机制上，主要系统由转录激活因子组成，如Clock和Bmal1，它们通过结合靶基因启动子区域的E-box元件发挥作用。Rev-erb-α，也称为核受体亚家族1组D成员1（NR1D1），是核受体家族中两种Rev-erbs蛋白之一。Rev-erb-α与ROR核受体竞争性激活和抑制时钟组件，构成一个完整的辅助环路，支持节律性。NR1D1基因在生物体中高度保守，并在骨骼肌中呈现振荡性表达。
Rev-erb-α是辅助分子节律的组成部分，并引发细胞特异性基因程序，促成骨骼肌下游表型。来自细胞培养实验、基因敲除动物和药理学干预的证据表明，Rev-erb-α控制肌肉质量和功能以及组织重塑。Rev-erb-α可促进减少萎缩的调控机制，协调骨骼肌中的自噬通路，同时改善钙稳态和再生过程。尽管Rev-erb-α在不同肌生成阶段可能表现出不同的mRNA水平，但最佳的Rev-erb-α水平可改善损伤后的肌纤维结构和核浓度。同时，Rev-erb-α可影响其内源性配体血红素的生物合成，后者精细调节代谢通路并促进能量消耗。越来越多的证据表明，Rev-erb-α对骨骼肌中的脂质代谢、钙稳态、能量平衡、线粒体生物发生和氧化能力产生积极影响，这些对组织完整性和健康至关重要。
运动训练作为一种强效的授时因子（zeitgeber），可改变骨骼肌昼夜节律的振幅和相位，从而改变时钟基因特征。急性运动后大多数时钟基因（包括Nr1d1）的转录表现出双峰调控，即运动后立即受到抑制，随后上调并恢复至基线。另一方面，慢性自由转轮和跑台有氧训练可增加成体和早衰小鼠骨骼肌中Rev-erb-α的转录和翻译水平。全球Rev-erb-α敲除导致啮齿动物肌肉质量减少、力量生成减弱以及长时间运动期间耐力受损，同时伴随最大摄氧量（VO2max）降低和线粒体呼吸能力下降。
2 调控Rev-erb-α稳定性与激活的复杂分子机制：转录、翻译和翻译后响应
NR1D1（Rev-erb-α）和NR1D2（Rev-erb-β）是旁系同源分子，共享约71%的氨基酸同一性，各含有一个由两个C4锌指基序组成的DNA结合域（DBD）。与经典核受体不同，Rev-erb-α和Rev-erb-β缺乏辅激活因子招募所需的AF-2螺旋，因此作为组成型转录抑制因子在负反馈环路中发挥作用。NR1D2与NR1D1共享昼夜节律和抑制功能，但在骨骼肌代谢中具有更细微、情境依赖且部分冗余的作用。尽管存在相似性，NR1D1主要影响骨骼肌重塑、线粒体表型和自噬，从而促进肌肉形态和性能。
复杂的转录、翻译和翻译后事件促成Rev-erb-α的定位、稳定性和功能。CLOCK:BMAL1异二聚体结合NR1D1启动子中的E-box元件，节律性激活NR1D1转录，其表达通常在骨骼肌中的白天达到峰值。Rev-erb-α转而结合靶基因（包括BMAL1）启动子中的ROR反应元件（ROREs）并抑制其转录。在ROREs处，Rev-erb-α与RORα竞争，后者在相同反应元件处激活转录。Rev-erb-α的活性也受代谢信号调节，包括其内源性配体血红素。血红素结合通过稳定其与NCoR/HDAC3辅抑制复合物的相互作用来增强Rev-erb-α的转录抑制活性，从而促进组蛋白去乙酰化并加强靶基因转录的抑制。
Rev-erb-α可在特定残基被磷酸化，导致不同的生物学结果。GSK-3β在丝氨酸55和59位点的磷酸化可稳定该蛋白，增强转录抑制活性。相反，CK1ε磷酸化N末端区域，影响蛋白在细胞质中积累的能力。CDK1的磷酸化可通过F-box蛋白FBXW靶向Rev-erb-α进行蛋白酶体降解。热休克蛋白（HSPs）在维持Rev-erb-α的蛋白质稳态中发挥关键作用，促进其正确折叠、功能性和及时降解。泛素连接酶驱动Rev-erb-α降解，例如Siah2过表达使Rev-erb-α不稳定，而Spsb4介导的Rev-erb-α降解可被蛋白酶体抑制。此外，Rev-erb-α的SUMO化可触发其泛素化，降低蛋白水平。DNA高甲基化可导致Rev-erb-α的转录和翻译抑制，PI3K/AKT1通路的过度激活触发DNA甲基转移酶3A（DNMT3a）的上调，从而降低Rev-erb-α表达。
3 Rev-erb-α在肌生成过程、骨骼肌结构和组织重塑中的双重作用
Rev-erb-α缺陷小鼠表现出胫骨前肌质量和横截面积（CSA）降低，以及纤维大小分布向较小直径偏移。全球Rev-erb-α缺陷还协调性增加了萎缩相关基因Fbxo32（Atrogin-1）和Trim63（MuRF1）的表达。相反，在C2C12细胞中Rev-erb-α过表达和SR9009药理学激活可抵消地塞米松诱导的萎缩变化。Rev-erb-α通过激活mTORC1促进成肌细胞分化，过表达Rev-erb-α可降低Tsc1 mRNA和蛋白水平，同时激活肌管中的TORC1。斑马鱼中Rev-erb-α的缺失导致肌肉生长改变和肌肉功能降低，导致成年动物过早出现肌肉减少症。
与上述研究相反，Chatterjee等人强调Rev-erb-α可抑制肌生成。缺乏Rev-erb-α的原代成肌细胞表现出改善的增殖和肌原性分化，Rev-erb-α的药理学激活降低肌原性调控因子（MRFs），而其拮抗剂（SR8278）则增加MRFs表达水平。在肌肉损伤后，全球Rev-erb-α缺失增强卫星细胞增殖扩增并加速再生进程。这些看似不同的发现可能反映了Rev-erb-α在肌生成中的阶段和模型依赖性功能。Welch等人研究了SR8278在杜氏肌营养不良（mdx）小鼠模型中的药理学拮抗作用，发现SR8278治疗改善了肌肉功能并减少了骨骼肌纤维化，伴随Wnt和Notch信号通路的激活。文献中报道的相互矛盾的发现可能归因于Rev-erb-α在肌生成和组织重塑中的双重作用。杂合动物（Rev-erbα+/?）在损伤后表现出增强的再生能力，快速恢复肌纤维结构、增加肌核密度和增大纤维CSA，表明Rev-erb-α表达降低可加速损伤后的肌肉修复，而完全缺失则可能对肌肉再生产生负面影响，提示Rev-erb-α在调节肌肉稳态中存在剂量阈值。
4 Rev-erb-α直接抑制骨骼肌中的自噬激活
昼夜节律时钟调节自噬的时机和活性，使细胞自我降解和回收与代谢需求同步。近期研究表明，分子昼夜节律时钟通过RORα/γ和NR1D1在肌肉外周时钟中的相互作用直接协调节律性自噬。在肌纤维中过表达NR1D1可能通过抑制自噬活性促进肥大。药理学上，Rev-erb-α激动剂SR9011抑制夜间自噬通量，而拮抗剂SR8278则增强之。在缺乏Rev-erb-α的小鼠中，骨骼肌表现出Ulk1和Beclin1 mRNA水平以及Bnip3蛋白水平升高，同时溶酶体酶如组织蛋白酶L和ATPase6v1b2也升高。C2C12细胞中Rev-erb-α过表达导致LC3蛋白水平升高，表明自噬通量可能受到阻碍。ChIP-seq分析显示，Rev-erb-α结合位点在C2C12肌管中多个自噬相关基因的调控区域内显著富集，这种结合与H3K27和H3K9标记处组蛋白乙酰化减少相关。在罗非鱼中，Rev-erb-α激动剂GSK4112处理显著升高Nr1d1水平，而关键自噬相关基因如Atg4c、Atp6v1d、Map1lc3a和Ulk1a则显著降低。在运动中，许多分析的自噬相关基因转录减少，与Rev-erb-α表达下降相吻合，支持Rev-erb-α对自噬相关基因的抑制活性。此外，Rev-erb-α通过调控Parkin表达（线粒体自噬的关键介质）促进线粒体生物发生、实施质量控制并促进功能失调细胞器的清除。
5 Rev-erb-α整合骨骼肌中的初级代谢和线粒体功能
Rev-erb-α调节骨骼肌中的能量代谢，包括脂肪沉积、糖异生和胆固醇稳态。分子层面，血红素以1:1化学计量直接结合Rev-erb-α，反之Rev-erb-α调节血红素合成，这种串扰通过血红素结合改变代谢酶和转录因子的活性与表达来调节代谢灵活性。Rev-erb-α缺失动物在高脂饮食暴露下表现出脂肪生成基因紊乱，Glut4 mRNA水平下调，而脂蛋白脂肪酶（LPL）组成性上调，促进脂肪储存。Rev-erb-α表达升高导致HDAC3招募至基因组，使肌肉在进食周期中协同全身碳水化合物的蛋白质或脂质同化来利用葡萄糖。Rev-erb-α敲除小鼠的股四头肌中与支链氨基酸（BCAA）分解代谢相关的多个基因上调。全球Rev-erb-α缺陷降低骨骼肌中的线粒体DNA含量、生物发生和电子传递链活性，这些特征与Ampk-Sirt1-Ppargc1-α信号通路失调相关。Rev-erb-α过表达增加线粒体数量、呼吸能力以及复合物I和III的蛋白含量。Rev-erb-α过表达还上调参与脂肪酸β氧化的酶，包括Ucp2、Ucp3、Acadl、Acads和Cpt1b，同时下调脂肪生成关键调控因子Fasn、Scd1和Srebf1。在药理学方法中，SR9009类似物有效降低高脂饮食小鼠循环中的甘油三酯、血糖和总胆固醇水平，并可通过抑制脂肪生成来预防昼夜节律紊乱诱导的体重增加和胰岛素抵抗。
6 急性运动对骨骼肌Rev-erb-α的调控
6.1 动物模型
急性耐力运动显著影响核心时钟基因在肌肉疲劳后的即时响应，表现出双峰调控：运动后立即抑制，随后上调。雄性小鼠股四头肌中Nr1d1 mRNA水平在运动后3小时较基线和久坐组降低。不同运动模式（耐力运动、间歇跑步和抗阻运动）的比较显示，在所有运动模式下，Nr1d1 mRNA水平在运动后18小时高于0和6小时。耐力运动和抗阻运动在运动后12小时降低了两种肌肉中的Nr1d1 mRNA水平。间歇跑步在18小时时产生比耐力运动更高的Nr1d1 mRNA水平，表明存在方案依赖性响应。在蛋白水平上，所有运动模式在运动后立即降低腓肠肌中的核Rev-erb-α含量。另一项研究发现，急性跑台运动仅在雄性小鼠的氧化型骨骼肌（比目鱼肌）中在运动后立即升高Nr1d1 mRNA水平，伴随萎缩相关基因表达增加。Rev-erb-α在调节炎症反应中发挥关键作用，抑制促炎细胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α，同时增强IL-10表达。IL-6与Rev-erb-α之间存在相互作用，IL-6敲除小鼠在基线和运动后条件下总Rev-erb-α蛋白水平较低。
6.2 人类研究
在训练有素的年轻成年人中，高强度的有氧运动后3小时恢复期，慢肌和快肌纤维中与昼夜节律调控相关的基因（PER1、HES1和NR1D1）表现出共同的下调响应。在业余耐力训练个体中，急性骑行运动后4和8小时，NR1D1 mRNA水平均降低，并与运动强度呈正相关。抗阻运动后3小时和8小时，NR1D1、PER1和PER2 mRNA水平保持较低，而ARNTL（BMAL1）上调。急性抗阻运动倾向于抑制时钟基因的波动并增加其变异性。在年轻男性中，1小时急性运动后观察到股外侧肌中NR1D1下调。在废用模型中，急性运动后2小时NR1D1在骨骼肌中下调，可能表明对活动不足导致的生理需求改变的适应性响应。
7 慢性运动和训练状态对骨骼肌Rev-erb-α上调的新兴作用
7.1 动物模型
开创性研究证明，8周跑台训练显著增加野生型训练雄性小鼠比目鱼肌和腓肠肌中的Rev-erb-α蛋白水平，改善线粒体功能和运动表现。4周慢性转轮活动后小鼠骨骼肌中Nr1d1基因表达增加，训练动物表现出食物摄入、体温和激素的显著波动。短期训练动物在早期活动期表现出比久坐动物更高的Nr1d1峰值，与HIF1a激活一致。有氧运动训练可上调Rev-erb-α上游靶蛋白（Clock和Bmal1）的表达，并可能通过增加线粒体融合蛋白2（MFN2）水平促进线粒体融合。在固定时间进行的慢性训练可能改变肌肉时钟基因表达模式。在肿瘤小鼠模型中，有氧训练组相比久坐癌症组具有更高的Nr1d1 mRNA水平，伴随肿瘤重量减少和肌okine表达向抗炎谱转变。在早衰小鼠模型中，8周耐力训练下调JAK2/STAT3通路，同时Nr1d1 mRNA水平和Rev-erb-α蛋白含量显著增加，有助于增加肌肉力量、耐力和肌肉CSA。中老年小鼠经低强度和高强度慢性游泳运动后，肌肉性能和Nr1d1 mRNA表达增加，而Arntl降低。相反，一项研究未观察到老年雄性动物骨骼肌中Nr1d1 mRNA水平在运动响应中的变化，这可能与最后一次运动与组织采集之间的间隔未明确以及仅使用RNA-seq单一时间点有关。在过度训练模型中，Rev-erb-α昼夜节律性丧失，且Rev-erb-α与犬尿氨酸3-单加氧酶（KMO）蛋白水平呈负相关。
7.2 人类研究
肥胖和2型糖尿病患者的原代人肌管与瘦人相比表现出减弱的节律性。相反，年轻男性耐力训练运动员比久坐受试者和代谢疾病患者具有更高的Rev-erb-α振幅。NAMPT和SIRT1基因表达的节律性仅在训练运动员中观察到。人体单核细胞中Rev-erb-α表达与体力活动和自然日光暴露显著相关。在一项纵向单腿设计中，超重和肥胖胰岛素抵抗男性完成12周高强度间歇训练后，尽管线粒体呼吸增加，但NR1D1 mRNA水平保持不变。综合来看，慢性运动对人体骨骼肌NR1D1/Rev-erb-α的影响是异质性的，而非统一诱导性的，需要直接比较有氧、抗阻和联合训练方案以确定运动模式、训练时机和参与者特征如何影响人体骨骼肌中Rev-erb-α相关响应。
