《Molecular & Cellular Proteomics》：Evolution and adaptations of the seminal proteome in an insect with traumatic insemination
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摘要翻译：精子和精液中的蛋白质组成对雄性适合度至关重要。然而，目前研究人员尚不清楚塑造精液蛋白质组组成的因素。常见臭虫（Cimex lectularius）通过创伤性授精进行交配，精子在穿越雌性生殖器和副生殖系统时，使射精液处于独特的选释环境中。本研究提供了首
摘要翻译：精子和精液中的蛋白质组成对雄性适合度至关重要。然而，目前研究人员尚不清楚塑造精液蛋白质组组成的因素。常见臭虫（Cimex lectularius）通过创伤性授精进行交配，精子在穿越雌性生殖器和副生殖系统时，使射精液处于独特的选释环境中。本研究提供了首个半变态昆虫精子与精液蛋白质组的高通量蛋白质组学表征，也是首次对雄性臭虫生殖系统进行深入的蛋白质组学表征。分析揭示了臭虫精子与精液蛋白质组中可能与创伤性授精相关的保守和独有特征。与大多数已研究的其他昆虫物种不同，臭虫精子蛋白质组表现出升高的分子进化速率，但也包含许多保守蛋白质。值得注意的是，研究人员发现臭虫和其他半变态昆虫共享精子亮氨酸氨基肽酶（S-Laps）的扩增。通过计算机模拟蛋白质-配体结合预测，研究人员表明S-Laps在臭虫中可能保留了催化活性。研究结果为未来研究这一日益扩张的全球性害虫奠定了基础。
论文解读文章：
一、研究背景与科学问题
精子和精液的蛋白质组成是雄性繁殖成功的关键决定因素。蛋白质作为配子的主要成分，在很大程度上决定了精子的形态和受精能力；同时，伴随精子转移的精液蛋白可辅助精子运输与储存，并影响交配后雌性的生理和形态。然而，由于长期以来缺乏研究射精液分子组成的高通量工具，人们对塑造精液蛋白质组组成与进化的因素仍了解有限。近年来，高通量鸟枪法蛋白质组学揭示了精子与精液蛋白质组包含数百至数千种蛋白质，且展现出复杂的景观：一些传统上被认为来源于副腺的精液蛋白可能起源于睾丸，而生殖蛋白质在表现出快速分子进化的同时也存在跨类群保守性。常见的臭虫采用专性创伤性授精，雄性插入器官（参数）刺穿雌性角质层，绕过仅用于产卵的雌性生殖道，将射精液注入雌性体内的中精囊（mesospermalege），精子随后以聚集体形式穿过血淋巴进入雌性生殖道并到达卵巢受精。这一独特的精子旅程使臭虫成为研究精液蛋白质组塑造因素的理想模型。基于此，研究人员提出假设：臭虫精液蛋白质组应包含保护和辅助精子穿越组织、膜及血淋巴的蛋白质，如免疫抑制因子、蛋白酶抑制剂、渗透压和氧化应激保护蛋白以及细胞粘附相关蛋白。
二、研究内容与主要结论
研究人员利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对雄性臭虫生殖系统四种组织/精子（精囊精子、睾丸、中腺和精液容器）进行无标记定量蛋白质组学分析，共鉴定5,290种蛋白质，经质控后保留3,806种臭虫蛋白质。主成分分析显示四种组织样本可完全分离，睾丸和中腺表达蛋白质数量最多，且彼此共享最多蛋白质。研究人员将精液产生器官（中腺和精液容器）中具有信号肽序列且组织偏向丰度的266种蛋白质定义为推定精液蛋白质组，并对每种组织/精子的偏向蛋白质组进行进化速率、染色体分布和基因本体（GO）富集分析。结果显示，臭虫精子蛋白质组（n=1,057）比基因组平均进化速率更快（平均dN/dS=0.20 ± 0.01），这与大多数其他昆虫物种中精子蛋白质组进化缓慢的模式相反；但在与果蝇一对一直系同源基因比较时，差异消失。精子蛋白质在X2染色体上欠表征，精子偏向蛋白在X1和X2上均欠表征。精液蛋白质进化速率与精子蛋白质相近，但未显著快于基因组平均。研究人员鉴定了129种可能与创伤性授精相关的候选蛋白，包括丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins）、分子伴侣（热激蛋白70/90）、超氧化物歧化酶、水通道蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶、凝集素和细胞粘附蛋白，但这些候选蛋白总体进化速率慢于基因组平均。通过与果蝇和埃及伊蚊精子及精液蛋白质组的比较，研究人员在臭虫精子蛋白质组中鉴定出311个果蝇精子蛋白直系同源物和95个埃及伊蚊精子蛋白直系同源物，且最丰富的精子蛋白中包含多个果蝇精子蛋白的直系同源物。特别值得注意的是，研究人员在臭虫中鉴定出13个精子亮氨酸氨基肽酶（S-Laps）直系同源物，其中5个属于“簇1”、8个属于“簇2”，均为精子中最丰富的蛋白质。系统发育分析表明S-Laps的起源早于全变态类与半变态类的分化，且在半翅目（豌豆蚜）和直翅目（双斑蟋）中未发现S-Lap直系同源物。基于M17氨基肽酶金属结合位点保守性分析和AlphaFold3蛋白质-配体结构预测，研究人员发现臭虫13个S-Laps中有11个保留至少4/5个金属离子结合残基，至少8个保留M17锌结合配位几何构型，表明大多数臭虫S-Laps可能仍具有催化活性，而果蝇中多数S-Laps因金属结合位点突变而活性减弱。这一模式在除果蝇外的所有研究物种中均存在，提示S-Laps在臭虫和其他昆虫中发生了保留活性位点的新功能化（neofunctionalisation），可能参与精子聚合与协作运动。
三、主要关键技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：（1）基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的无标记定量蛋白质组学，使用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪对臭虫（Cimex lectularius）雄性生殖系统四种组织/精子（精囊精子、睾丸、中腺、精液容器）进行蛋白质鉴定与定量，每组织四个生物学重复，总计16个样本；样本来自2006年在英国伦敦采集、在德国德累斯顿工业大学维持的F4种群，品系为大型远交种群。（2）利用OrthoFinder进行层级直系同源鉴定，与臭虫近缘和远缘物种（包括热带臭虫、锥蝽、豌豆蚜、种子甲虫、埃及伊蚊、黑腹果蝇、双斑蟋）进行比较基因组学分析。（3）基于PAML计算非同义/同义替换速率比（dN/dS）评估分子进化速率，并通过BLASTn将基因定位到染色体水平基因组组装（Clec_2.1）上分析染色体分布。（4）利用SignalP 6和Phobius预测信号肽序列，使用topGO进行基因本体（GO）富集分析。（5）使用AlphaFold3预测蛋白质与两个Zn2?离子的结合构型，结合M17氨基肽酶保守金属结合基序比对和ChimeraX结构分析，评估S-Laps的锌配位几何和催化活性。
四、研究结果分述
（一）雄性生殖蛋白质组的全面表征
睾丸表达蛋白质数量最多（n=2,959），其中25.9%具有组织偏向丰度；精子蛋白质组（n=1,057）中41.8%具有细胞偏向丰度；中腺表达蛋白质数量第二（n=2,335），组织偏向蛋白比例最高（42.5%）。精子与睾丸蛋白质组中信号肽序列蛋白显著低表征，而中腺和精液容器中信号肽蛋白显著富集。睾丸蛋白质组GO富集包括三羧酸循环、微管过程、蛋白质折叠等；精子蛋白质组富集线粒体内膜、运动纤毛、微管、轴丝、动力蛋白复合体等典型精子结构成分。沃尔巴克氏体（Wolbachia）蛋白在睾丸/菌胞体样本中丰度最高。精子蛋白质在X2染色体上欠表征，精子偏向蛋白在X1和X2上均欠表征，但X连锁基因总体进化速率与常染色体无差异。
（二）精液蛋白质组与创伤性授精候选蛋白
推定的精液蛋白质组包含266种含信号肽的组织偏向蛋白，其中39.1%也在睾丸中表达，1.5%在精子中表达，支持部分精液蛋白具有睾丸起源。精液蛋白GO富集包括蛋白质折叠、蛋白水解、糖基化、肽酶活性负调控等。研究人员鉴定出129种创伤性授精相关候选蛋白：中腺和精液容器中含丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins）和凝集素；睾丸和精子中含S-Laps、凝集素、水通道蛋白、热激蛋白（HSP70/90）、谷胱甘肽过氧化物酶等。这些候选蛋白整体进化速率慢于基因组平均（p < 0.001），其中精子候选蛋白的dN/dS边际显著低于精子蛋白质组平均（p = 0.0469）。
（三）与其他物种精液蛋白质组的比较
臭虫精子蛋白质组中鉴定出311个黑腹果蝇精子蛋白直系同源物和95个埃及伊蚊精子蛋白直系同源物；最丰富的精子蛋白包括果蝇精子蛋白直系同源物（如betaTub56D、bb8）、S-Laps、线粒体蛋白（P5CDh1、Cs1、sea、mAcon、Mitofilin）和Y连锁生育因子（ORY、WDY、Ppr-Y、kl-3、kl-5）。精液蛋白质组仅含14个果蝇精液蛋白直系同源物和6个埃及伊蚊精液蛋白直系同源物。臭虫精子蛋白在果蝇一对一直系同源物比较中未显示加速进化，提示快速进化可能局限于臭虫特异谱系。
（四）精子亮氨酸氨基肽酶（S-Laps）的进化与功能
研究人员在臭虫中鉴定出13个S-Lap直系同源物，均为精子中最丰富的蛋白（前20个高丰度精子蛋白中有5个为S-Laps）。系统发育分析显示S-Laps在昆虫中首先按簇（簇1或簇2）聚类而非按物种聚类，表明其起源早于全变态类与半变态类分化；S-Laps存在于鞘翅目（种子甲虫）、双翅目（果蝇）和半翅目（臭虫、锥蝽）中，但不存在于豌豆蚜和双斑蟋中。果蝇中多数S-Lap活性位点突变，而臭虫大多数S-Laps（11/13）保留至少4/5个金属结合残基，且结构预测显示至少8个S-Laps保留M17锌配位几何构型，预测为可能具有催化活性。研究物种中除果蝇外（以及种子甲虫簇1的部分S-Lap）均保留活性位点。这些结果支持S-Laps在臭虫中保留酶活性，可能在精子聚集中发挥作用，而果蝇中该酶活性可能发生次级丢失。
五、讨论与结论
本研究表明，臭虫精液蛋白质组存在与创伤性授精相关的独特进化特征。精子蛋白质组表现出升高的分子进化速率，可能由放松选择或创伤性授精引发的性对抗共进化驱动；但许多高丰度精子蛋白仍高度保守。精液蛋白质组未表现出常见的快速进化模式，可能反映精子穿越血淋巴等过程的强烈净化选择。臭虫精液中含有大量保护精子免受免疫攻击、渗透压和氧化应激损伤的蛋白质，以及可能参与精子聚合的凝集素和S-Laps。精子蛋白在X染色体上的欠表征与果蝇、线虫和小鼠中的模式一致，而中腺蛋白在X2上过表征，可能反映了性拮抗等位基因的积累。S-Laps在臭虫中保留催化活性，支持其可能在精子协作和聚合中发挥功能，而果蝇中该活性的丧失可能代表一种谱系特异性的新功能化事件。总之，该研究将臭虫精液蛋白质组的覆盖率提高了两个数量级，为这一全球性害虫的生殖生物学和进化研究提供了重要资源，并为未来害虫防控策略的开发奠定了基础。
