《Neurogastroenterology & Motility》：Types of Neurons in the Myenteric Plexus of Human Gastric Corpus Identified by Multi-Layer Immunohistochemical Coding and Vagal Tracing
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背景：肠神经元调节肠道的运动、分泌、血流和免疫功能。表征神经元类型对于理解肠神经系统如何工作以及其在疾病中如何出错至关重要。
方法：研究人员利用手术标本检查了人胃体肌间神经丛。多重免疫组化评估了15种标志物，包括泛神经元标志物（HuC/D）、神经递质相关酶、
背景：肠神经元调节肠道的运动、分泌、血流和免疫功能。表征神经元类型对于理解肠神经系统如何工作以及其在疾病中如何出错至关重要。
方法：研究人员利用手术标本检查了人胃体肌间神经丛。多重免疫组化评估了15种标志物，包括泛神经元标志物（HuC/D）、神经递质相关酶、一氧化氮合酶（NOS）、胆碱乙酰转移酶（ChAT）、酪氨酸羟化酶（TH）、囊泡乙酰胆碱转运体（VAChT）、递质血清素（通过5-HT蓄积）、神经肽P物质（SP）、脑啡肽（ENK）、降钙素基因相关肽（CGRP）、生长抑素（SOM）、血管活性肠多肽（VIP）、神经肽Y（NPY）、钙结合蛋白钙结合蛋白（Calb）、钙网蛋白（Calret）以及结构蛋白神经丝200（NF200）。这些标志物被应用于来自7例个体的胃体1084个肌间神经元。使用生物素酰胺示踪标记标本边缘可见的壁内迷走神经分支的轴突。
关键结果：根据免疫组化标志物之间的显著关联（“化学编码”），区分出12类肠神经元，包括运动神经元和可能的中间神经元、分泌运动神经元及血管运动神经元。由VAChT、ENK、SP或TH标记的致密轴突膨体簇（“篮状结构”）大量分布在ChAT+肌间神经元胞体周围，但在NOS+细胞周围则显著稀少。由生物素酰胺标记的迷走神经篮状结构对NOS+或ChAT+细胞均未表现出整体偏好。
结论：人胃肌间神经元的多种类型可根据其免疫组化特征加以区分。迷走神经传出通路与胃体肌间神经丛的所有类别神经元均相关联，而某些肠内在通路可能表现出具有整合潜力的选择性连接。
关键点：人胃体肌间神经丛包含至少12类神经细胞，可通过其表达的神经元免疫组化标志物组合（“化学编码”）加以区分。本研究从化学编码、胞体-树突形态和连接性方面描述了人胃中的神经元类别。
通俗语言摘要：研究人员使用多重免疫组化和离体迷走神经壁内分支示踪技术研究了人胃体肌间神经丛。通过15种免疫组化标志物之间的显著关联，可区分出12类肌间神经元。其中许多类别与先前描述的特定胞体-树突形态类型相关。检查胞体周围免疫组化标记的轴突膨体簇（“篮状结构”）提供了可能的连接性指示。通过生物素酰胺填充肉眼可见的迷走神经分支所显现的篮状结构与全部12类肌间神经元均相关。而针对特定免疫组化标志物标记的篮状结构（可能包含更多内在来源的轴突）则显示出与特定类别肌间神经元的选择性关联。这些结果表明，人胃肠神经元形成功能性回路，而不仅仅是迷走神经输入的简单中继站。
**论文解读：人胃体肌间神经丛神经元类型鉴定：多层免疫组化编码与迷走神经示踪的综合研究**
**一、研究背景与目的**
肠神经系统（enteric nervous system, ENS）由分布于胃肠道壁内的数百万肠神经元组成，通过肌间神经丛和黏膜下神经丛形成复杂的神经回路，协调调控胃肠运动、分泌、血流及免疫功能。不同消化道区域功能迥异，其ENS回路亦可能存在区域性差异。胃作为低压贮器，承担混合食物与胃液并以受控方式排入十二指肠的功能。既往免疫组化研究已在实验动物中揭示神经肽分布存在胃与肠道间的差异，功能上亦有不同，例如豚鼠胃中慢兴奋性突触后电位罕见而小肠中丰富。人胃黏膜下神经丛较肠道稀疏，而外在神经支配中迷走神经通路在胃部更为广泛。然而，针对人胃肌间神经丛神经元类型及其化学编码的系统性表征仍十分有限。传统多标记免疫组化最多可同时评估4种标志物，难以全面揭示神经元亚型的分子表型。此外，迷走神经传出纤维如何靶向不同类别肌间神经元，以及肠内在回路是否具备整合能力，尚不明确。为此，本研究采用多层免疫组化编码结合离体迷走神经示踪技术，对人胃体肌间神经丛神经元进行系统分类，并探究其连接模式。
**二、研究设计与主要技术方法**
研究获取42例接受袖状胃切除术患者的手术胃标本，其中7份制备物（5名女性，中位年龄45岁，范围31–67岁）用于多层免疫组化分析，另4份用于5天器官培养研究。标本取自胃体背侧（n=6）或腹侧（n=1）表面，去除黏膜和黏膜下层后，对邻近小弯侧切缘处肉眼可见的迷走神经干进行生物素酰胺（biotinamide）离体顺行示踪。示踪后组织经固定、穿透、荧光标记，在共聚焦显微镜下成像。多层免疫组化采用抗体洗脱技术，依次施加7或8层抗体组合，对每个神经元评估15种标志物，包括泛神经元标志物HuC/D、神经递质合成酶（NOS、ChAT、TH）、囊泡转运体VAChT、5-HT蓄积、神经肽（SP、ENK、CGRP、SOM、VIP、NPY）、钙结合蛋白（Calb、Calret）及结构蛋白NF200。通过强制选择范式记录每个胞体各标志物阴阳性、周围篮状结构（basket）及形态学分类。采用有监督分裂式层次分析，先按NOS和ChAT分为四群，再依据卡方检验确定最有判别力的标志物进行迭代二分，最终获得12个不可再分的神经元类别。
**三、主要研究结果**
**1. 单细胞标志物表达：** 共分析1084个人胃体肌间神经元（每例84–222个，中位数124个）。ChAT为最丰富标志物，表达于80.7%神经元；NOS表达于25.1%（其中7.9%同时为ChAT+）；NF200、Calb、VIP、ENK分别表达于74.4%、24.9%、21.9%和15.1%；其余标志物均低于10%。
**2. 标志物组合的非随机性：** 每个神经元平均表达13种胞体标志物中的2.7±1.2种。最常见的组合为ChAT+/NF200+（21.1%），且不表达其他标志物。将观察到的组合频率与随机组合期望值比较，发现部分组合显著过表达或低表达，例如NOS+/ChAT+/NF200+细胞实际仅占1.1%，而随机期望为7.2%，表明13种标志物存在非随机共表达。
**3. 聚类产生12类神经元：** 基于NOS和ChAT将细胞分为四群：NOS+/ChAT+（7.9%）、NOS+/ChAT?（17.2%）、NOS?/ChAT+（72.8%）、NOS?/ChAT?（2.1%）。迭代划分后共得到12个类别：NOS+/ChAT+群分为2类（依据VIP），NOS+/ChAT?群分为3类（依据VIP和Calb），NOS?/ChAT+群分为6类（依据SP、TH、ENK和VIP），NOS?/ChAT?群不再细分。各类别胞体大小差异显著，1类（NOS+/ChAT+/VIP+）最大（1130±535 μm2），12类（NOS?/ChAT?）最小（413±226 μm2）。
**4. 免疫组化篮状结构的连接分析：** 10种标志物可标记篮状结构，共识别1629个篮状结构围绕720个神经元（66.4%）。最常见为VAChT篮（48.5%胞体），其次为ENK（27.7%）、SP（21.5%）、TH（15.9%）。不同篮状结构对特定标志物胞体具有选择性，如VAChT+篮在ENK+、ChAT+、TH+胞体周围过表达，而在NOS+、Calb+、VIP+、NPY+胞体周围显著低表达。按12类分析，NOS+的1–5类整体接受较少的ENK+和VAChT+篮，而NOS?/ChAT+的6–11类接受显著更多的ENK和VAChT篮。
**5. 胞体形态学分类：** 依据NF200染色将神经元分为Dogiel II型、Dogiel III型及5种Dogiel I亚型（spiny、stubby、hairy、simple）和NF200阴性型。Dogiel II型和spiny-I型与NOS+、Calb+、VIP+正相关；stubby-I型中ENK+比例偏高；NF200阴性细胞与SP和TH正相关，与NOS、ENK、Calb、VIP、NPY负相关。形态类型与12类神经元显著关联，如NOS+/ChAT+两类富含spiny-I型和较少NF200阴性细胞；33个Dogiel II型细胞中81.8%为NOS+，且多为大细胞，与肠道中罕见NOS的Dogiel II型IPANs明显不同。
**6. 迷走神经生物素酰胺示踪：** 生物素酰胺填充可标记沿肌间神经丛走行长达25 mm的轴突，并在神经节内形成大量膨体轴突和篮状结构。经5天器官培养后，填充的神经毡密度显著降低，而VAChT免疫反应性篮仅中度减少，表明大部分生物素酰胺填充的神经毡源于迷走传入/传出纤维，而部分胆碱能篮源于内在神经元。定量分析显示，生物素酰胺标记的膨体中27.7%为VAChT阳性，16.5%为TH阳性，无同时阳性膨体。
**7. 迷走篮的靶向性分析：** 使用Imaris三维分析比较10个有生物素酰胺篮围绕的神经元与10个无篮神经元，发现前者胞膜3 μm范围内膨体比例更高，表明篮状结构代表集中输入。但按13种标志物分类或按12类化学编码分类，均未发现迷走生物素酰胺篮对任何类别有显著偏好（分别p=0.191和p=0.086）。这表明迷走传入/传出纤维广泛支配所有类别肌间神经元，而内在肠回路则表现出选择性连接。
**四、讨论与结论总结**
讨论部分指出，胃体肌间神经丛包含多种功能类别：1、2类为NOS+/ChAT+神经元，可能为中间神经元（DINs），因乙酰胆碱和NO分别作为主要的兴奋性和抑制性神经递质，二者共存提示非肌肉运动神经元。3–5类为NOS+/ChAT?，几乎均为NF200+，很可能构成抑制性肌肉运动神经元（IMMNs），其中3类富含VIP和NPY，4类缺乏VIP，这反映了肌肉运动神经元化学编码的异质性。6–11类为NOS?/ChAT+胆碱能神经元，6、7类表达SP，可能部分为兴奋性肌肉运动神经元（EMMNs）或中间神经元；6类共表达TH提示存在多巴胺能神经元；8类表达ENK而不含SP，可能为中间神经元；9类为ChAT+/VIP+，可能支配泌酸黏膜的壁细胞、主细胞和D细胞；10类为ChAT+/TH+，可能为胆碱能/多巴胺能中间神经元；11类为最丰富类别（39.3%），仅表达ChAT而很少表达其他测试神经肽，可能包含众多缺乏SP/ENK的EMMNs。12类缺乏ChAT和NOS，功能不明。此外，Dogiel II型神经元在胃中极为稀少（3%），远低于小肠（9%）和结肠（5%），提示该类型在胃中的功能权重较低。
在迷走神经支配方面，生物素酰胺标记显示迷走传出纤维与所有12类肌间神经元均有接触，与以往啮齿类动物中“几乎所有胃肠神经元接受迷走传出接触”的观察一致。然而，免疫组化标记的内在篮状结构（如VAChT、ENK、SP、TH）则明显偏向胆碱能类别（6、8、10、11类），而回避NOS+的抑制性类别（3、4、5类）。这种差异性表明，胃体肌间神经丛具备整合能力而非简单的中继站：迷走输入广泛分布，但内在回路通过选择性化学编码形成特定突触连接，可能分别调控兴奋性与抑制性通路，从而实现胃容纳、混合及排空等复杂功能。研究还讨论了肥胖患者中可能存在的IGLE减少，以及胃体取材区域包含容纳与推进两种运动模式的代表性。最终结论强调，人胃体肌间神经丛至少存在12类可经化学编码区分的神经元，迷走传出通路与所有类别相关联，而某些肠内在通路展示出选择性连接潜力，这为理解人胃ENS回路组织提供了新见解。
