USP9X抑制促进自噬介导的胞内肉毒神经毒素A清除并加速功能恢复

《NeuroToxicology》：USP9X Inhibition Promotes Autophagy-associated Clearance of Intracellular Botulinum Neurotoxin A and Accelerates Functional Recovery

　　• USP9X抑制显著促进细胞内BoNT/A轻链的清除。• USP9X敲低通过抑制AKT-mTOR信号通路增强自噬活性。• AMPK-ULK1通路的激活与USP9X抑制诱导的LC清除有关。• 药物性激活自噬可加速BoNT/A诱导的瘫痪恢复。• USP9X是促进肉毒毒素中毒后恢复的潜在宿主靶标。引言A型肉毒神经毒素（BoNT/A）作为一种有效的治疗药物，被广泛用于肌张力障碍、痉挛、疼痛综合征及其他神经肌肉疾病的治疗。然而，尽管具有重要的临床价值，不当使用可导致长时间松弛性瘫痪，严重损害运动功能（Dressler, 2016, Breidenbach and Brunger, 2005）。其广泛的临床应用与中毒风险，凸显了深入了解毒素暴露后恢复机制的必要性（Pirazzini et al., 2022, Liu et al., 2022）。BoNT/A作用时间长的原因主要归因于其轻链（LC）在细胞内的持久存在，因此细胞内LC的清除很可能是功能恢复的关键决定因素。作为锌依赖性内肽酶，BoNT/A的LC切割SNAP-25，从而阻断突触囊泡外排和神经递质释放。因此，确定促进细胞内LC清除的有效机制，为开发加速BoNT/A中毒恢复的新策略提供了基础（Fernandez-Salas et al., 2004, Gardner and Barbieri, 2018, Pellett et al., 2018）。目前，针对BoNT/A中毒的治疗策略仍然有限（Rao et al., 2021）。传统方法，如抗毒素抗体，仅在暴露后及时给药时有效，因为它们主要在毒素进入神经元之前中和循环中的毒素（Rao et al., 2021, Machamer et al., 2022）。3,4-二氨基吡啶也被报道可通过增强神经肌肉接头处的神经递质释放来缓解早期肉毒中毒症状（Ojala et al., 2021, Bradford et al., 2018），但其临床应用受到安全问题的限制。这些局限性凸显了替代方法的必要性，特别是通过促进细胞内LC的清除。泛素-蛋白酶体系统（UPS）已被证明参与LC的周转，几种去泛素化酶（DUBs）被鉴定为LC持久性的调节因子（Tsai et al., 2024, Ishihara et al., 2023, Sen et al., 2021）。其中，VCIP135直接结合LC的C末端区域，通过去泛素化保护其免于蛋白酶体降解。USP9X是另一种被鉴定为LC持久性调节因子的DUB，但未检测到两者之间的直接结合（Tsai et al., 2010, Tsai et al., 2017）。这种差异表明，USP9X可能通过替代机制调控BoNT/A-LC的清除，可能是通过调节宿主细胞的降解环境，而不是直接作用于毒素本身。USP9X是一种高度保守的DUB，在维持细胞蛋白质稳态和调节多种与蛋白质降解相关的信号通路中发挥重要作用。尤其值得注意的是，越来越多的证据表明USP9X与自噬相关信号网络有关（Zheng et al., 2024），包括PI3K-AKT-mTOR（Roldan-Romero et al., 2023）和AMPK-ULK1（Zhang et al., 2022）通路，两者都是自噬-溶酶体依赖性降解的核心调节因子。鉴于BoNT/A-LC的细胞内持久性可能由自身的稳定性以及宿主细胞的降解能力共同决定，我们假设USP9X作为关键的宿主因子，通过抑制细胞降解通路来限制LC的清除。在本研究中，我们探讨了USP9X抑制是否能促进LC清除并促进中毒后的恢复。基于稳定的LC过表达细胞模型，我们进行了慢病毒介导的USP9X敲低、转录组学分析、生化分析和自噬的药理调节。然后，我们描述了USP9X如何通过调节宿主降解信号通路来调控LC的持久性，具体通过抑制AKT-mTOR通路和激活AMPK-ULK1轴。我们进一步在BoNT/A中毒的大鼠模型中验证了这一自噬-溶酶体依赖性机制。结果表明，药物性抑制USP9X加速了BoNT/A注射后腓肠肌的功能恢复。该效应在体内上调自噬后也得到了实现。总之，这些发现表明USP9X是LC清除的宿主负调节因子，并提示靶向USP9X可能代表一种促进BoNT/A中毒后恢复的潜在治疗策略。章节片段实验对象本研究使用雄性Sprague-Dawley大鼠（220-240 g），购自上海悉普-百凯实验动物有限公司。所有动物护理和实验程序均严格按照《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物No. 85-23，1996年修订）进行，并获得了同济大学机构动物护理和使用委员会的批准。动物在受控条件下饲养（25°C，12小时光照/黑暗周期），自由进食和饮水。USP9X抑制促进细胞内BoNT/A轻链的清除为了研究USP9X在肉毒神经毒素A型轻链（LC）细胞内稳定性中的作用，我们首先建立了一条稳定过表达FLAG标记LC的细胞系。如图1A所示，表达盒被设计为组成性表达Flag标记的LC。Western blot分析结果证实，LC过表达细胞中Flag-LC的表达量丰富，而在野生型细胞中几乎检测不到信号。该工程化细胞系中，BoNT/A-LC被……讨论BoNT/A中毒的临床挑战主要源于其轻链（LC）蛋白酶在运动神经末梢中的非凡细胞内存活性（Whitemarsh et al., 2014）。虽然传统抗毒素抗体能有效中和循环的细胞外毒素，但对已内化的LC基本无效，使患者不得不忍受长时间的瘫痪。因此，发现可被……的特定细胞内通路……结论总之，我们的研究表明USP9X抑制BoNT/A轻链的清除。USP9X的抑制促进细胞内LC的移除，并加速中毒后的功能恢复，这与自噬-溶酶体依赖性降解、AKT-mTOR信号通路的抑制以及AMPK-ULK1信号通路的激活有关。这些发现提供了关于BoNT/A持久性的宿主机制的新见解，并突出了USP9X作为治疗靶标的转化潜力……伦理声明本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究获得了同济大学机构动物护理和使用委员会的批准。利益声明B.S.是兰州生物技术发展有限公司的副总经理，该公司为本研究提供了部分资金支持，并为动物实验提供了肉毒毒素。兰州生物技术发展有限公司还与同济大学联合建立了神经毒素研究中心。B.S.参与了初始项目设计，但未参与后续实验、数据获取、统计分析、主要数据解释……作者贡献声明X.X.进行了实验，分析了数据，并撰写了稿件。Y.L.、Y.S.和L.J.设计了项目并监督了研究。B.S.参与了初始项目设计、资金获取，并为动物实验提供了肉毒毒素。X.X.、Y.L.、L.P.、K.Z.、L.L.、Y.Y.、B.S.、Y.S.和L.J.审阅并讨论了稿件。所有作者审阅并批准了稿件的最终版本。资金本研究得到中国国家自然科学基金（82001199）、上海市卫生和计划生育委员会科研项目（20194Y0030）、中国国家临床重点专科建设项目（Z155080000004）、上海康复医学研究中心（上海顶级优先研究中心）（2023ZZ02027）、上海医院发展中心基金会-临床技术创新项目（SHDC12020119）、上海医院发展中心……CRediT作者贡献声明Ying Liu：写作——审阅与编辑、监督、资金获取、概念设计。Xuerui Xiang：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、可视化、验证、方法学、形式化分析、数据整理。Yuyang Yan：写作——审阅与编辑。Kunshan Zhang：写作——审阅与编辑。Lizhen Pan：写作——审阅与编辑。Lixi Li：写作——审阅与编辑。Baogang Sun：监督、项目管理、资金获取。Lingjing Jin：写作——审阅与……利益冲突声明作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系。Baogang Sun报告与兰州生物技术发展有限公司的关系，包括：董事会成员和雇佣关系。如果有其他作者，他们声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本研究中报告的工作。Xuerui Xiang|Ying Liu|Lixi Li|Lizhen Pan|Kunshan Zhang|Yuyang Yan|Baogang Sun|Yunping Song|Lingjing Jin