跨物种转录组学揭示植物水分亏缺响应的共享核心基因与过程

《The Plant Genome》：Cross-species transcriptomics uncovers shared responses to water deficiency in plants

加深对调控植物胁迫响应的保守分子机制的认识，是鉴定参与耐受不利环境条件的新核心基因和过程的基础。为此，研究人员开发了一种生物信息学流程，用于检索并整合来自目标物种的胁迫相关 RNA-seq（RNA sequencing）转录组数据，并鉴定参与胁迫响应的核心物种特异性及跨物种保守基因和过程。研究人员利用该方法研究了 Arabidopsis thaliana、Triticum aestivum 和 Solanum lycopersicum 干旱响应的分子机制。研究人员发现，激素信号传导、活性氧（reactive oxygen species, ROS）分解代谢、细胞壁组织、光合作用及防御机制在至少两个物种中响应干旱而失调。在已鉴定的跨物种保守差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）中，PUB19、EDL3、RAB18 和 AAP6 被证实对干旱响应起关键作用。共表达网络鉴定出支撑干旱响应的核心基因，如叶片中的 HB-7 和根中的 P5CS1。借助 PlantConnectome，还检测到若干未在 Gene Ontology（GO）中归类为干旱响应的基因，包括 EULS3、PUB19、BFT、DAA1，分别参与碳水化合物识别、泛素化、脱落酸（abscisic acid, ABA）信号传导和膜完整性维持，提示需要进一步研究。总之，所开发的方法被证明可有效鉴定核心干旱响应基因和过程，并具有应用于其他植物物种和胁迫类型的潜力。

研究背景与问题：植物在不利环境条件下会启动多种生理和分子调整，其中部分机制在植物界共享，部分为物种特异。干旱是危害最大的非生物胁迫之一，可触发植物激素级联及其互作，涉及脱落酸（abscisic acid, ABA）、水杨酸、乙烯、茉莉酸信号转导和独脚金内酯等，并涉及活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平调控。干旱还抑制光合作用，以减少过量 ROS 造成的损伤。公共 RNA-seq（RNA sequencing，转录组测序）数据数量巨大，但多数研究以单一物种为中心，忽略了跨物种整合可能带来的信息。独立实验间的批次效应会影响数据整合，因此需要统计方法减少技术变异并保留生物学效应。该研究旨在整合 Arabidopsis thaliana、Triticum aestivum 和 Solanum lycopersicum 的干旱转录组响应，鉴定共享生物学过程和基因，为未来植物育种应用提供候选核心基因与框架。

研究人员开展的研究及结论：研究人员开发了一个新的生物信息学流程，用于整合公共 RNA-seq 数据，校正批次效应，并对每个物种进行差异表达分析和受影响生物学过程探索。研究发现，激素信号传导、ROS 分解代谢、细胞壁组织、光合作用和防御机制在至少两个物种中响应干旱而失调。跨物种保守差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）中，PUB19、EDL3、RAB18 和 AAP6 被确认在干旱响应中起关键作用。共表达网络鉴定出叶片中的 HB-7 和根中的 P5CS1 等核心基因。借助 PlantConnectome，还发现 EULS3、PUB19、BFT 和 DAA1 等未在 Gene Ontology（GO）中归类为干旱响应的基因，分别涉及碳水化合物识别、泛素化、ABA 信号传导和膜完整性维持。该研究意义在于提供可应用于其他植物物种和胁迫类型的流程，并促进对干旱耐受核心机制的理解。

关键技术方法：研究人员于 2025 年 2 月 2 日查询 Sequence Read Archive（SRA，序列读取档案），检索 A. thaliana、T. aestivum 和 S. lycopersicum 的干旱或水分胁迫相关 RNA-seq 数据，并整合 BioSample 与 SRA 元数据。经手动筛选，保留 2024 年 12 月 31 日前发布且 2025 年 1 月 31 日前关联论文的 BioProjects，要求包含对照和干旱条件，排除错误注释、其他生物、突变体和其他胁迫样本。样本来源为公共 SRA BioProjects。研究人员使用 LSTrAP-Cloud 流程，通过 kallisto 将样本伪比对到 A. thaliana（TAIR10）、T. aestivum（IWGSC）和 S. lycopersicum（SL3.0）参考转录组，过滤后获得 count 和 transcripts per million（TPM，每百万转录本）矩阵，并将转录本水平汇总到基因水平，再用 DESeq2 进行 size-factor 标准化。按物种-器官组合使用 ComBat-seq 校正批次效应，并进行主成分分析（principal component analysis, PCA）。采用 DESeq2 鉴定 DEGs，阈值为 Benjamini-Hochberg 校正 p ≤0.05 且 |log₂FoldChange| ≥ log₂(1.5)。使用 gprofiler2 进行功能富集，并使用 PlantConnectome 构建“PlantConnectome drought”自定义基因集。使用 OrthoFinder 获得直系同源组（orthogroups, OGs）和差异表达直系同源组（differentially expressed orthogroups, DEOs）。使用 BioNERO 构建共表达网络，并用 Cytoscape 可视化。

研究结果：
3.1 干旱胁迫转录组数据的检索与处理：研究人员通过 SRA 筛选和手动校正，获得 16、22 和 22 个 BioProjects，分别包含 242、250 和 420 个样本，对应 Arabidopsis、小麦和番茄。质量统计显示，Arabidopsis 的伪比对 reads 比例最高，为 73%，番茄为 66.2%，小麦为 63.4%；映射基因平均比例排序相同。通过质量过滤的研究和样本数为 Arabidopsis 16（201）、小麦 21（228）、番茄 14（334）。该结果表明新流程能够检索、处理和整合跨物种干旱转录组数据。

3.2 探索性分析揭示干旱胁迫研究间高变异性：PCA 显示，在批次校正前，三个物种的样本并未按处理分离，而主要受采样时间、胁迫天数、器官、BioProject 等因素影响。使用 ComBat-seq 校正后，叶片和根中处理与主成分的相关性增强，在 Arabidopsis、小麦和番茄中处理成为主要变异驱动因素。该结果说明批次校正可有效减轻研究间技术差异，并揭示干旱处理的生物学效应。

3.3 差异基因表达分析：研究人员分别在整合的物种-器官数据集和单个 BioProject 中进行差异表达分析，并计算 Jaccard 指数（Jaccard Index, JI）评估 DEG 集合相似性。单个 BioProject 中，Arabidopsis 根下调基因中位 DEG 数最低，为 897；小麦叶片上调基因最高，为 4918。整合集中，Arabidopsis 叶片下调 DEG 最低，为 199；小麦叶片上调 DEG 最高，为 9886。根在 Arabidopsis 和小麦中比叶具有更高的 DEG 集合相似性，番茄则不然。高绝对倍数变化 DEG 包括 Arabidopsis 中的 DAA1、AITR1、F5K20_280、AT1G54575、LEA46；小麦中的多个 ABA 响应脱水素和 Wcor18；番茄中的 SOLYC09G082330.2、LE25、WAKL20、SOLYC03G116390.3、SOLYC01G087180.3。Arabidopsis 中还发现多个 MYB 转录因子（transcription factor, TF）差异表达，尤其在根中。该分析提供了各物种和器官中稳健的干旱响应候选基因。

3.4 富集与直系同源分析：研究人员使用整合 DEG 进行功能富集，并只展示在至少两个物种中富集的过程。结果显示，激活过程比抑制过程在叶和根间及物种间更保守，Arabidopsis 中重叠最高，番茄最低。根中所有物种共享 13% 的激活过程，包括“response to abiotic stimulus”“response to temperature stimulus”和“PlantConnectome drought”；叶片中“PlantConnectome drought”是唯一在三物种中均激活的过程。抑制过程在根中仅“response to stress”为三物种共享，叶片中无重叠。“PlantConnectome drought”在所有物种和器官组合中均激活。PlantConnectome 检索到的基因数明显多于 GO 的“response to water deprivation”和“response to water”类别，番茄中差异最明显。EULS3、BFT、PUB19 和 DAA1 是 PlantConnectome 富集但不在 GO 水分响应类别中的例子。直系同源分析显示，43.1% 的 DEG 映射到物种特异 OGs，小麦比例更高，为 56%；共享 OGs 中 DEG 的全球比例为 47.3%，Arabidopsis 和番茄超过 75%，小麦为 33.7%。根比叶具有更保守的干旱响应，根共享 OGs 为 2.3%，叶为 0.6%。Arabidopsis 与番茄的 DEO 保守性最高，其次为小麦与番茄，最后为 Arabidopsis 与小麦。叶片中上调基因比例较高，物种特异 DEOs 中为 60%，保守 DEOs 中为 64%；根中平均为 46%。叶片跨物种保守且高平均倍数变化 DEG 包括上调的 PUB19、EDL3、AT4G36700，以及下调的 COR413-PM4 和 AAP6。根中包括上调的 RAB18、CBSX4、T1G11.19，以及下调的 GDPD2 和 FLOT1。该分析鉴定了跨物种保守的干旱响应基因和直系同源关系。

3.5 共表达网络分析揭示共享干旱响应模块：研究人员在 Arabidopsis 叶片和根中分别构建共表达网络。叶片鉴定出 6 个模块，包含 34 至 134 个基因；根鉴定出 25 个模块，包含 31 至 385 个基因。叶片的 black 和 green 模块、根的 darkorange 模块富集于水分胁迫响应相关过程，如“response to water”“response to water deprivation”和“PlantConnectome drought”。在叶片 black 模块中，研究人员过滤保留 hub 基因、TF 及其直接邻居，发现 ERF023、HB-7 和 HB-12 在三个物种中差异表达；ANAC072、NFYA5 和 HB-7 为 hub 基因，8 个 TF 存在于 PlantConnectome drought 集合。ERF023 在 Arabidopsis 中上调，并与 GOLS2、MTP9、REM4.2、PYD4、REM4.1、NIPA2、MMG4.18 共表达；HB-7 和 HB-12 与 LEA14、ALDH7B4、AFP1、HAB1、AIRP2 共表达。根中鉴定出两个 TF，其中一个为跨物种保守下调的 FBH4。根中 hub 基因包括跨物种保守的 RAB18 和 DAA1，以及存在于 PlantConnectome 集合中的 P5CS1。该结果表明共表达网络可揭示跨物种保守的干旱响应候选调控关系。

讨论总结：讨论指出，非生物胁迫严重限制作物生产，阐明植物适应和耐受机制对提高作物韧性和可持续生产至关重要。公共 RNA-seq 数据丰富，但样本注释常不完善，需要人工校正；研究间批次效应和其他实验变量会影响整合。该研究中 PCA 在校正前显示处理效应被其他因素掩蔽，ComBat-seq 校正后处理效应显现。讨论也提醒，校正模型仅显式保留处理因素，其他生物因素相关变异可能被部分减弱，但单个 BioProject 间 DEG 重叠有限，说明仍存在残余生物变异。差异表达分析鉴定出多个 ABA 响应基因，如 DAA1、AITR1、RAB18、LE25，以及 DREB2A、LEA46、多个 MYB、NAC 和 WAKL20。富集分析显示激素和 ABA 响应、ROS 代谢、防御反应、光合作用和细胞壁组织等过程参与干旱响应。PlantConnectome 比 GO 水分响应类别检索到更多基因，在番茄中尤其有价值，并发现 EULS3、BFT、PUB19、DAA1 等基因。直系同源分析显示 Arabidopsis 与番茄 DEO 重叠最高，符合二者均为双子叶植物；小麦 DEG 和物种特异 DEO 最多，可能与其六倍体基因组及与双子叶植物遗传距离较远有关。共表达网络发现 ERF023 与 GOLS2 等共表达，HB-7 和 HB-12 与 LEA14 等共表达；根中 FBH4 保守下调，RAB18、DAA1 和 P5CS1 为 hub 基因。讨论同时指出，共表达网络仅基于 DEG，可能排除表达未显著改变的调控因子，因此 hub 基因和 TF 应视为候选调控因子。

研究结论翻译：总之，研究人员设计了一种新的流程，用于从大量收集的 RNA-seq 数据出发对转录组数据进行整合分析，以利用多项研究并鉴定任何植物物种中特定胁迫涉及的核心过程和基因。将该方法应用于干旱胁迫后，研究人员获得了关于 A. thaliana、小麦和番茄中该条件响应涉及的若干核心过程和基因的见解，包括物种特异和跨物种保守者。此外，PlantConnectome 被证明是扩展 GO 功能富集的有力工具，能够扩大基因功能信息并跨物种转移新的生物学知识。研究人员鉴定出许多尚未经实验表征的基因，并推断了干旱响应基因之间的新关系，凸显了在物种特异和跨物种水平推进植物干旱耐受基因知识的潜力。