《Plant Science》：Developmental dynamics of ascorbic acid metabolism in wild jujube fruit: An integrated physiological and transcriptomic analysis
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•野生枣中的AsA和T-AsA在幼果期达到峰值；与'灵武长枣'相比，其发育过程中的变化存在差异。•综合分析将VTC2、GLDH、HXK2、PGMP和一种bHLH因子与AsA代谢联系起来。•瞬时过表达ZjVTC2使本氏烟草的叶片AsA增加了72.65%，但没有证据证明存在速率限
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野生枣中的AsA和T-AsA在幼果期达到峰值；与'灵武长枣'相比，其发育过程中的变化存在差异。
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综合分析将VTC2、GLDH、HXK2、PGMP和一种bHLH因子与AsA代谢联系起来。
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瞬时过表达ZjVTC2使本氏烟草的叶片AsA增加了72.65%，但没有证据证明存在速率限制。
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WGCNA和基因-性状分析确定了候选基因；GLDH、HXK2、PGMP和bHLH仍未经证实。
引言
野生枣（Ziziphus jujuba var. spinosa）是鼠李科枣属的一种落叶灌木或小乔木。它是栽培枣的野生祖先，具有经济、药用和生态价值（Peng等，2002）。野生枣果实含有多糖（Yuan等，2024）、维生素（Huang等，2017）、脂肪酸（Ma等，2022）和类黄酮（Liang等，2008）。它还含有各种矿物质元素（Hua等，2022）。果实特别富含L-抗坏血酸（AsA），也称为维生素C。其维生素C含量达到每100克果实830–1170毫克，约为普通枣的两倍（Fan，2008）。这一水平明显高于柑橘和草莓等普通水果。因此，野生枣在开发具有天然抗氧化功能的食物方面具有独特优势。尽管野生枣资源丰富且AsA含量高，但其AsA积累的分子调控机制仍知之甚少。特别是，与栽培枣相比，其独特性的遗传基础尚不清楚。
AsA是生物体中一种重要的抗氧化剂。它参与活性氧清除（Smirnoff，2000）、光合作用保护（Barth等，2006）、细胞分裂和细胞伸长（de Pinto等，1999，Veljovic-Jovanovic等，2001）。因此，它对于植物和动物都至关重要。人类不能合成AsA，必须通过饮食获取。植物中AsA的积累由生物合成和回收共同决定。利用拟南芥突变体，（Wheeler等，1998）证明这两个过程都对AsA稳态有贡献。植物有四种已知的AsA生物合成途径。它们是L-半乳糖途径（Wheeler等，1998）、D-半乳糖醛酸途径（Agius等，2003）、L-古洛糖途径（Wolucka和Van Montagu，2003）和肌醇途径（Lorence等，2004，Munir等，2020）。L-半乳糖途径被认为是高等植物中的主要途径（Wheeler等，1998）。L-半乳糖酮-1,4-内酯脱氢酶（GalLDH）和肌醇氧合酶（MIOX）是关键限速酶（Munir等，2020）。AsA-谷胱甘肽循环通过单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）和脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）再生AsA（Hou等，2017）。相比之下，抗坏血酸过氧化物酶（APX）催化其氧化消耗（Li等，2013，Li，2023）。
植物感知环境变化后，AsA的生物合成和代谢由多个调控因子介导，其中转录因子居中。相关证据来自番茄（Solanum lycopersicum）、猕猴桃（Actinidia spp.）和其他作物。转录因子如SlHZ24和AceMYBS1通过调控生物合成基因影响AsA含量（Hu等，2016，Liu等，2022，Zheng等，2022）。AsA代谢相关基因的表达在种间差异为改善AsA含量提供了分子靶标（Yang等，2011，Caruso等，2021）。先前的研究表明，野生枣群体中的AsA含量明显高于栽培枣群体，且变异更大。通过整合转录组和代谢组分析，Lu等（2022）确定了枣果实中调控AsA积累的关键基因。他们报道了ZjMDHAR在AsA回收中的重要作用，并使用加权基因共表达网络分析鉴定了ZjERF17、ZjbZIP9和ZjGBF4作为候选调控因子。Bi等（2023）发现，除幼果期外，野生枣在各阶段的AsA含量均高于栽培枣。在群体水平上，野生枣的平均AsA含量显著更高且变异更大，而栽培枣的分布更窄。然而，对野生枣的系统研究仍然稀缺。特别是，其高AsA含量究竟反映了更大的生物合成能力、更低的降解，还是更高效的底物供应，仍不清楚。
从野生枣到栽培枣的驯化不仅改变了果实大小，还改变了糖酸组成和营养积累。基因组研究表明，与糖和有机酸代谢相关的基因位于驯化选择区域。栽培枣通常结出更大的果实，含糖量更高，酸度更低（Huang等，2016）。栽培'骏枣'与野生'青剪'枣的发育比较进一步表明，野生材料果实更小，含糖量更低，有机酸和AsA含量更高。这些差异涉及果实膨大、AsA生物合成和AsA回收（Huang等，2021）。然而，很少有研究在共同环境和匹配发育阶段的同时比较形态、糖、酸、AsA氧化还原状态和相关酶活性。因此，跨发育的配对生理测量对于分离共同的成熟效应和与基因型相关的AsA积累差异至关重要。
转录丰度、共表达网络和基因-性状相关性可以识别候选基因，但本身无法确立因果关系。VTC2编码GDP-L-半乳糖磷酸化酶，催化L-半乳糖途径中的一个关键承诺步骤。在烟草叶片中瞬时表达猕猴桃的同源蛋白使AsA增加了三倍以上。稳定和瞬时过表达研究也鉴定了GGP/VTC2作为植物AsA生物合成的主要调控节点（Laing等，2007，Bulley等，2009，Wang等，2014）。因此，在N. benthamiana中瞬时过表达可以检验ZjVTC2是否促进AsA积累。然而，这一证据来自异源叶片系统，不能替代野生枣果实中的同源遗传验证。
本研究有四个目标。首先，我们表征了野生枣果实发育过程中的形态、糖、酸、AsA和相关酶活性的发育变化。其次，我们比较了这些性状与'灵武长枣'在对应发育阶段的表现。第三，使用转录组分析、WGCNA和RT-qPCR筛选与野生枣果实中AsA积累相关的候选基因。最后，使用瞬时过表达初步检验优先候选基因VTC2是否促进AsA积累。
章节摘要
植物材料
实验在中国宁夏灵武市大全林场1000亩设施园艺水果基地（北纬37°58′43″，东经106°14′42″）进行。植物材料包括野生枣（Ziziphus jujuba var. spinosa）和Ziziphus jujuba Mill. cv. '灵武长枣'，它们在相似的土壤和田间管理条件下生长。野生枣材料由刘佳佳进行系统分类鉴定，并指定了登录号SZ-X。凭证标本（凭证号SZ-X）
果实形态和糖酸性状的发育变化
两种材料的果实形态、糖和酸在发育过程中均发生变化，但遵循不同的轨迹（图1）。野生枣的纵径、横径和单果质量总体呈增加趋势。单果质量在成熟期达到2.12 ± 0.05克，而成熟的'灵武长枣'则为26.67 ± 0.18克。线性混合效应模型显示单果质量存在显著的品种×阶段交互作用（F?,?? = 1842.44，P < 0.001）。
野生枣
讨论
本研究系统表征了野生枣果实发育过程中的阶段依赖性AsA代谢。其他高AsA水果的研究同样将发育中的AsA积累与生物合成和回收酶的动态变化联系起来（An，2005，Xia等，2016）。柿子类型的比较代谢组和转录组研究同样表明，AsA积累取决于发育和基因型（Wang等，2023）。在野生枣中，AsA和T-AsA在
结论
本研究调查了野生枣中的发育AsA代谢及其与'灵武长枣'的生理对比。它表征了与果实发育过程中AsA积累相关的阶段依赖性生理性状和转录组候选基因关联。得出以下结论：
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野生枣中的AsA和T-AsA遵循阶段依赖性的非单调轨迹。两者在幼果期最高，在着色期最低，在成熟期部分恢复。
CRediT作者贡献声明
刘思佳：撰写-初稿、可视化、方法论、概念化。李思思：软件、方法论。王佳栋：正式分析、数据管理。何凯明：监督、资源。高淑荣：可视化、调查。刘佳佳：项目管理、经费获取、概念化。
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的可能影响本论文报告的工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本研究得到国家自然科学基金（项目编号32060338）的支持，项目题目为"扦插繁殖与嫁接繁殖'灵武长枣'果实品质差异的机制研究"。
刘思佳|李思思|王佳栋|何凯明|高淑荣|刘佳佳
