蛋白质组引导的药物发现定位并减轻靶向降解剂的治疗毒性

《Nature Chemical Biology》：Proteome-guided drug discovery maps and mitigates therapeutic degrader toxicity

异双功能靶向降解剂（HBDs）能够高效去除蛋白质靶标，但其临床成功可能受到其双价化学结构固有的从头毒性（de novo toxicity）的阻碍。研究人员在此提出一种药物发现框架，利用高通量蛋白质组学来定位并减轻新兴药物模式的毒性机制。将雄激素受体（AR）阴性细胞暴露于用于治疗耐药性前列腺癌的实验性AR-HBDs库中，研究人员将广泛的蛋白质组响应与邻苯二甲酰亚胺降解剂的肝毒性联系起来。基于蛋白质组训练的机器学习将主要毒性机制定位为电子传递链复合物I的抑制，并鉴定出更安全的类似物，其中连接区的微小修饰减轻了脱靶结合。蛋白质组优化的降解剂表现出降低的肝毒性、增强的特异性以及对治疗耐药性前列腺癌异种移植模型的抗肿瘤活性。这些发现建立了一个开发更安全药物的通用框架，并凸显了蛋白质组引导的药物发现的变革潜力。

尽管对人类疾病机制的认识取得了重大进展，许多疾病仍然缺乏有效疗法。美国国立卫生研究院（NIH）认定的罕见病中超过90%没有获批治疗，而已批准的药物也仅在部分患者中有效。蛋白质组中蕴含着广泛的药物靶标，但许多蛋白质难以通过经典小分子设计策略靶向，小分子开发周期长、疗效不足和毒性问题使其成本高昂且风险巨大。异双功能靶向降解剂（HBDs）通过招募E₃泛素连接酶，借助泛素-蛋白酶体系统实现靶蛋白降解，为靶向疾病相关蛋白开辟了新机会。其中招募cereblon（CRBN）的降解剂因药效学优势成为多种癌症药物开发的重点，但其双价化学结构本身可能引发从头毒性，阻碍临床成功。在前列腺癌治疗中，AR-HBDs被开发用于克服抗雄激素治疗耐药，但尚无候选药物能在具有可接受安全性的同时展现出优于标准治疗的疗效。因此，亟需在药物开发早期阶段检测并减轻脱靶效应。

针对这一问题，研究人员开发了一个利用高通量数据非依赖采集（DIA）蛋白质组学定位和减轻新型药物毒性机制的药物发现框架。研究人员将不表达雄激素受体（AR）的HepG₂人肝癌细胞暴露于78种美国食品药品监督管理局（FDA）批准药物和包含204个实验性AR-HBDs的化合物文库，通过质谱分析获得了大规模蛋白质组响应，并结合机器学习模型预测和解析毒性机制。结果显示，多个临床前或临床阶段的CRBN招募型AR-HBDs的主要脱靶毒性源于对电子传递链（ETC）复合物I的抑制；通过连接区的微小化学修饰，研究人员鉴定出保留抗肿瘤活性且肝毒性显著降低的类似物。该研究建立了通用框架，有助于开发更安全的药物，凸显了蛋白质组引导的药物发现的变革潜力，相关成果发表于《Nature Chemical Biology》。

关键技术方法：该研究主要采用了基于96孔板的高通量DIA质谱（扫描SWATH和dia-PASEF平台），并用DIA-NN进行肽段鉴定与定量；样本包括HepG₂细胞（ATCC CRL-3581）、原代人肝细胞（BioIVT）及C4-2异种移植模型（NOD-SCID小鼠）。差异表达分析（limma）、基因集富集分析（GSEA）和STRING富集分析用于解析通路；线性回归和梯度提升决策树（GBDT）机器学习结合SHAP分析预测并解释线粒体毒性；线粒体功能验证包括半乳糖培养基细胞活力、Seahorse耗氧率（OCR）、牛心肌线粒体复合物I/II活性测定；此外还使用了原代人肝细胞毒性试验、免疫印迹和RNA-seq。

“蛋白质组捕获多种药物类别的脱靶机制”：用78种FDA批准药物处理HepG₂细胞，47种药物未引发显著蛋白质组变化，31种药物诱导显著变化；蛋白质组不仅反映药物作用机制，还揭示脱靶结合，例如抗真菌药克霉唑通过CYP450酶系统等产生广泛蛋白质组扰动。主成分分析可分离治疗窗口小、毒性潜力高的药物类别，说明蛋白质组能够捕获脱靶机制。

“蛋白质组绘制靶向降解剂的脱靶结合”：研究人员对一个包含204个AR-HBDs的文库进行了大规模蛋白质组检测。由于HepG₂细胞不表达AR，其响应反映了脱靶效应。与FDA批准药物相比，AR-HBDs诱导更广泛的蛋白质组变化；其中VHL招募型降解剂扰动较弱，而CRBN招募型降解剂扰动强烈。化学系列聚类与化合物结构相关，表明蛋白质组可系统绘制降解剂的脱靶结合。

“招募CRBN的AR-HBDs破坏线粒体呼吸”：功能富集分析显示，AR-HBDs显著扰动线粒体蛋白复合物相关通路。在依赖线粒体呼吸的半乳糖培养基中，多个CRBN招募型AR-HBDs以剂量依赖方式抑制HepG₂细胞活力；而单独的来那度胺（lenalidomide）等组成部分无此作用，提示该毒性为双价化学结构获得的新功能，且源自线粒体。

“招募CRBN的AR-HBDs抑制呼吸链复合物I”：通过线性回归和GBDT机器学习，研究人员将毒性机制定位到ETC复合物I，其中NDUFA5等复合物I亚基是重要预测特征。Seahorse实验显示化合物1（一种来那度胺-5N偶联的AR-HBD）显著降低细胞耗氧率，尤其在最大呼吸阶段；牛心肌线粒体实验证实化合物1以纳摩尔浓度抑制复合物I催化的NADH氧化，而复合物II活性不受影响。

“蛋白质组训练的机器学习模型鉴定安全AR-HBDs”：研究人员将训练好的模型应用于整个降解剂文库，预测毒性评分显示临床进展较快的化合物（如bavdegalutamide和gridegalutamide）毒性评分较高。化合物2和3与化合物1属于同一来那度胺系列，仅在连接区或7-甲氧基修饰上不同，却获得较低毒性评分，提示连接区微小修饰可减轻脱靶结合。

“鉴定化合物减轻了脱靶毒性”：实验验证表明，化合物2和3不诱导复合物I相关蛋白质组改变，在HepG₂半乳糖培养基中几乎不影响细胞活力，不抑制Seahorse耗氧率和复合物I活性，在原代人肝细胞中耐受浓度达20 μM以上，而化合物1的IC₅₀约为2.7 μM。此外，化合物2和3仅抑制AR阳性前列腺癌细胞系增殖，对AR阴性细胞无活性，保留了对靶点的选择性。

“化合物3在体内具有强效AR特异性和活性”：化合物3在LNCaP和C4-2细胞中剂量依赖地降解AR并抑制前列腺特异性抗原（PSA）表达；RNA-seq显示其调节雄激素反应通路的能力与恩杂鲁胺相似，且不影响氧化磷酸化。在C4-2去势抵抗前列腺癌异种移植模型中，口服化合物3（30 mg kg^-1，每日一次）3天使肿瘤内AR蛋白降低>70%；28天给药产生56%肿瘤生长抑制（TGI），显著优于恩杂鲁胺（50 mg kg^-1，15% TGI），且小鼠体重无明显下降。

总结讨论：讨论部分指出，随着具有复杂多药理作用的药物进入临床，脱靶效应的早期解析日益重要。该研究证明，线粒体毒性是CRBN招募型AR降解剂的主要脱靶机制，且可被蛋白质组学定位到ETC复合物I；蛋白质组训练的机器学习模型提示，连接区微小修饰足以减轻该毒性。化合物3在动物模型中的抗肿瘤疗效优于标准治疗恩杂鲁胺，同时耐受良好，验证了蛋白质组引导设计的可行性。此外，在FDA批准药物中，该模型也能通过ETC相关特征区分已知肝毒素（如曲格列酮）与较安全的同类药物，表明该方法具有更广泛的适用性。

研究结论：总之，系统应用细胞蛋白质组学和机器学习，将HBDs的不良蛋白质组特征与其化学结构特征相关联，从而指导设计更安全的化合物。通过快速检测和减轻脱靶毒性机制，现代蛋白质组学有望成为降低药物开发风险、加速药物开发的有效解决方案。