《Exploration》：Endogenous Trigeminal Neurons Induce Schwann Differentiation of Donor Stem Cells in Dental Pulp Regeneration via Reciprocal Extracellular Vesicles Interplay
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干细胞移植恢复受者器官功能的潜力受到供体细胞与宿主组织整合不良的限制。在此，研究人员通过移植人脱落乳牙干细胞（human deciduous tooth stem cells，SHED）成功再生了小型猪根管内的牙髓。植入的SHED分化为多种功能细胞，尤其是Sc
干细胞移植恢复受者器官功能的潜力受到供体细胞与宿主组织整合不良的限制。在此，研究人员通过移植人脱落乳牙干细胞（human deciduous tooth stem cells，SHED）成功再生了小型猪根管内的牙髓。植入的SHED分化为多种功能细胞，尤其是Schwann细胞（Schwann cells，SCs），其吸引并包裹再生牙髓中重新生长的宿主轴突。SHED与宿主三叉神经节（trigeminal ganglion，TG）之间的双向细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）通讯调控牙神经再生。来源于SHED的EVs（SHED-EVs）促进轴突生长，而由TG神经元（TG neurons，TGN）释放的EVs诱导SHED分化为SCs。吞噬SHED-EVs的TGN分泌内源性EVs（endogenous EVs，ST-EVs）并迁移至再生牙髓组织。来源于TGN的ST-EVs富含TUFM（Tu translation elongation factor, mitochondrial），其反过来促进SHED的Schwann细胞分化（SC differentiation）。该研究强调了在器官再生中供体细胞与宿主组织整合期间细胞信号交换的重要性。
研究背景与问题：供体细胞移植为组织再生提供了重要治疗策略，但供体细胞与宿主组织整合不良限制了器官功能恢复。牙髓再生因植入干细胞处于相对保护性腔室中，是研究供体-宿主相互作用的模型。人牙髓中周围相关SCs参与牙神经支配，并在牙本质-牙髓界面形成胶质网络，对病原抵抗和牙本质修复重要。牙发育中，大量间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可来源于神经相关SCs，牙髓再生可重演发育轨迹；MSCs与神经元共培养可分化为SCs。TG来源感觉神经调控牙发育和稳态。既往研究人员利用自体SHED实现人牙髓再生并恢复牙感觉。EVs介导细胞间通讯，MSC来源EVs可促进轴突再生，且EVs可被神经元末梢吞噬并逆行运输。因此，研究人员推测功能性牙髓再生需要植入细胞与宿主TG间双向EVs通讯，并开展了异种SHED植入、单细胞分析、体内外示踪及机制研究。该论文发表于《Exploration》。
关键技术方法：研究人员建立小型猪切牙去髓后SHED植入模型及大鼠上颌第一磨牙牙髓再生模型，SHED来源于人脱落乳牙，并采用免疫缺陷小鼠皮下移植模型。采用micro-CT、HE染色、免疫荧光、TEM、NTA、western blot进行形态与EVs表征；用scRNA-seq、RNA-seq、GO、GSEA、CellChat、Monocle2伪时间分析解析细胞组成、来源、轨迹和通讯；用GFP、CD63-mCherry、PKH26/PKH67、DiR、AAV9-hsyn-CD63-mCherry及GW4869、Dynasore、shRAB27A/shRab27a进行体内外示踪和功能干预；用4D-label free蛋白质组学、Seahorse OCR检测EVs蛋白与代谢。
研究结果：
2.1 SHED植入再生牙髓，SCs包裹神经。研究人员将SHED植入去髓小型猪切牙根管，micro-CT显示根管形态与正常相似，HE染色示全牙髓再生并伴成牙本质细胞层和血管。免疫染色显示正常和再生牙髓中βIII Tub
+轴突被S100b
+和MBP
+ SCs包裹，并表达CGRP、TRPV1和TRPM8。scRNA-seq鉴定九个细胞群，包括内皮（PECAM
+/RAMP2
+）、m-SCs（MPZ
+/MBP
+）、SCs（CADM1
+/GFAP
+）、DPCs（ACTA2
+/MYH11
+）、MSCs（PTN
+/THY1
+）等；再生牙髓中SC相关标记细胞约49.3%，正常仅1.0%。结论为异种SHED植入可成功再生牙髓，SCs可能对神经再支配和感觉恢复关键。
2.2 植入SHED以反馈驱动方式与宿主内源细胞整合再生牙髓。3个月和6个月再生牙髓中轴突强度及SCs分布增加。scRNA-seq显示植入细胞可分化为DPCs、内皮、MSCs和SCs；GFP
+ SHED验证其分化为SCs、成牙本质细胞和内皮细胞。6个月时植入细胞中SC相关标记达19.0%，MSCs降至0.4%；宿主来源以SCs/m-SCs（29.7%）和DPCs（15.5%）为主。Monocle2伪时间示MSCs→SCs→m-SCs轨迹；h-mit与GFAP
+ SCs共表达而不与轴突共表达，说明轴突来自宿主TG。CellChat示植入MSC与内源细胞通讯呈反馈驱动。结论为牙髓再生依赖植入与内源细胞整合，再生牙神经由宿主TG轴突与植入SHED来源SCs组成。
2.3 SHED-EVs触发宿主轴突生长和牙神经再生。GW4869预处理SHED后植入，再生轴突强度降低且SC分化受损。SHED-EVs呈球形双层膜，平均直径143.5 nm，表达CD9、CD63、TSG101、Alix，阴性Calnexin。示踪显示SHED-EVs迁移至同侧TG并在TGN胞体积累。RNA-seq示TGN内化SHED-EVs后轴突再生相关基因富集，391个基因上调、36个下调；SHED-EVs直接加入原代TGN促进轴突生长，抑制SHED-EVs分泌则降低轴突生长。结论为SHED-EVs迁移至TG并被TGN吞噬，促进宿主轴突生长。
2.4 供体SHED与宿主TG间双向EVs通讯在牙神经再生中作用。共培养2、4、6、8周，轴突密度6周达峰，而SHED向SCs分化持续增至8周；体内皮下移植模型同样显示轴突6周平台、SC分化至8周。GSEA示TGN内化SHED-EVs后多囊体、内吞囊泡膜和囊泡介导运输信号富集。AAV9-hsyn-CD63-mCherry标记显示TGN-EVs可到达植入SHED。GW4869注射TG抑制EVs分泌后，再生牙髓轴突仍可支配但SC分化显著抑制；GW4869-SHED组轴突和SCs均少。体外抑制SHED-EVs降低轴突，抑制TG-EVs降低SC分化。结论为双向EVs通讯关键，轴突再生先于并促进SC分化。
2.5 TGN内化SHED-EVs后来源EVs在体外促进SHED向SCs分化。TGN-EVs为双层膜球，平均135.4 nm，表达CD9、CD63、TSG101、Alix，阴性Calnexin。PKH67-TGN-EVs与PKH26-SHED-EVs混合显示SHED偏好摄取TGN-EVs，TGN偏好摄取SHED-EVs。用shRAB27A-SHED消除SHED-EVs干扰后，TGN预内化SHED-EVs可增强轴突再生和SC分化；Dynasore抑制TGN摄取则减弱。shRab27a抑制TGN分泌ST-EVs后SC分化降低。结论为ST-EVs促进SHED向SCs分化。
2.6 ST-EVs富含TUFM和GFM2促进SHED向SCs分化。ST-EVs平均122.6 nm。ST-EVs处理使SHED形态更伸长，Schwann相关标记高于PBS、SHED-EVs、TGN-EVs；共培养和皮下移植中ST-EVs组S100b、MBP更高。4D-label free蛋白质组比较显示ST-EVs中TUFM和GFM2显著增加，WB示ST-EVs中最高。SHED-EVs刺激后TGN胞体和轴突中TUFM、GFM2、TOMM20与CD63共定位随时间增加；体内SHED植入后TG中上述共定位也增加。结论为TGN内化SHED-EVs后，ST-EVs上调并包装TUFM和GFM2，促进SHED SC分化。
2.7 ST-EVs转移TUFM促进SHED的SC分化。大鼠Tufm与人TUFM相似性93.81%，Gfm2与人GFM2相似性82.53%；结构预测显示TUFM的N端线粒体靶向序列人鼠相似，GFM2呈倒置。shTufm降低ST-EVs中TUFM后，ST-EVs不能诱导SHED伸长和Schwann标记，而ST-EVsshGfm2仍可诱导。Seahorse示ST-EVs增强SHED的OXPHOS（基础呼吸、ATP产生、最大呼吸），ST-EVsshTufm作用较弱。共培养和皮下移植中ST-EVs比ST-EVsshTufm更强促进SC分化。下调SHED TUFM抑制OXPHOS和SC分化，ST-EVs可挽救；过表达TUFM增加SC相关标记并促进SC分化。结论为ST-EVs递送TUFM对SHED SC分化关键。
讨论部分：该研究识别了植入SHED命运，即分化为SCs；机制上，供体SHED与宿主TG通过双向EVs通讯调控牙神经再生。供体-宿主整合对功能组织再生重要，但当前模型限制了对细胞通讯机制的理解。既往研究表明自体SHED可分化为成牙本质细胞，宿主神经血管供血；本研究人-猪、人-鼠嵌合牙髓再生模型具有研究供体细胞与宿主内源细胞整合的优势。植入细胞通过旁分泌招募宿主成分，宿主神经血管则提供再生微环境。EVs通讯呈双向：SHED-EVs诱导TG神经支配，TGN-EVs逆行诱导SC分化；二者偏好相互摄取而非自摄取。时间序列存在，顺序EVs通讯增强TGN诱导SC分化能力。EVs可递送线粒体蛋白或mtDNA激活OXPHOS；ST-EVs携带更多TUFM和GFM2，其中TUFM同源性高且关键。周围神经损伤中SCs形成Büngner带；本研究发现牙髓再生中神经长入早于SC分化，可能因神经在富含ECM的MSC支架中直接生长，而SC分化较慢。正常牙髓中超过四分之三SCs无髓，与感觉神经末梢相关，参与修复性牙本质形成。小鼠牙发育中MSCs起源于周围神经相关SCs，分化为牙干细胞和成牙本质细胞；本研究观察到显著比例MSCs分化为SCs，提出感觉神经支配可能重演牙发育并影响植入SHED命运决定，但机制仍需研究。局限包括：缺少异种SHED移植后感觉神经功能评估；时间序列需原位移植模型验证；异种移植需评估免疫相关检测。
研究结论翻译：综上所述，该研究表明宿主TG与异源植入的SHED通过双向EVs互作协调再生功能性牙髓。来源于植入干细胞的EVs迁移至宿主TG以激活轴突再生。作为反馈机制，来源于宿主TG的EVs在内化SHED-EVs后，携带更高浓度的TUFM返回供体细胞，从而诱导SC分化。研究结果凸显宿主与供体细胞之间的双向EVs互作协调外源与内源整合，促进功能性组织再生的实现。
