《Signal Transduction and Targeted Therapy》：SARS-CoV-2 seeds IAPP aggregation and β-cell failure
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全球糖尿病发病率在COVID-19大流行后激增，然而SARS-CoV-2如何驱动长期β细胞（β-cell）衰竭的机制尚未完全阐明。研究人员鉴定了一种机制，即SARS-CoV-2结构蛋白直接劫持胰岛淀粉样多肽（islet amyloid polypeptide，
全球糖尿病发病率在COVID-19大流行后激增，然而SARS-CoV-2如何驱动长期β细胞（β-cell）衰竭的机制尚未完全阐明。研究人员鉴定了一种机制，即SARS-CoV-2结构蛋白直接劫持胰岛淀粉样多肽（islet amyloid polypeptide，IAPP）以诱导致病性淀粉样沉积，在年龄易感的胰岛微环境中破坏胰岛素颗粒的成熟、运输和分泌。在猕猴模型中，老年受试者表现出广泛的胰岛IAPP聚集伴β细胞坏死性凋亡（necroptosis）增加，而成年感染动物仅表现出极轻微的IAPP病理改变。多重荧光原位杂交（multiplex fluorescence in situ hybridization）检测病毒正义和反义RNA并结合IAPP免疫染色，揭示了老年胰岛中活跃病毒复制灶与IAPP富集淀粉样区域之间存在局灶性重叠。分子对接（molecular docking）被用作假设生成的工具，而免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）、邻位连接分析（proximity ligation assays）和表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）实验证实了刺突蛋白（spike）/核衣壳蛋白（nucleocapsid）与IAPP的直接结合；界面引导的肽段突变分析进一步表明，预测的五个IAPP接触残基为结合所必需。硫黄素-T（Thioflavin-T）动力学和电子显微镜（electron microscopy）研究表明，刺突蛋白/核衣壳蛋白显著加速IAPP单体向致密纤维网络的转化。在β细胞和过表达人IAPP（hIAPP）的原代小鼠胰岛中，刺突蛋白/核衣壳蛋白的表达或蛋白暴露降低了胰岛素含量，并诱导内质网应激（endoplasmic reticulum stress）和炎症程序。整合的空间胰岛蛋白质组学（spatial islet proteomics）将IAPP-病毒复合物与补体激活和囊泡运输功能障碍联系起来。关键的是，原代胰岛qPCR和免疫印迹分析揭示了停滞的胰岛素mRNA伴随运输/胞吐转录本的代偿性上调，但胰岛素前体蛋白积累，与颗粒成熟/加工受损一致。因此，SARS-CoV-2蛋白作为IAPP组装的致病性“种子”，建立了IAPP聚集-颗粒成熟受损-补体激活-囊泡运输阻断轴，这是COVID-19后糖尿病年龄相关易感性的基础。
一、研究背景与科学问题
COVID-19大流行后全球糖尿病发病率显著攀升，临床流行病学证据表明SARS-CoV-2感染不仅引起急性呼吸道综合征，还与多种慢性代谢性疾病（如糖尿病）的发生和恶化密切相关。大规模队列研究证实SARS-CoV-2感染与长期糖尿病风险呈正相关，尤其是在重症患者或已有代谢风险的人群中。然而，呼吸道病毒如何导致持久的β细胞功能障碍，其机制基础尚未完全阐明。现有竞争性模型包括直接内分泌感染、间接炎症损伤、胰岛素敏感性改变以及应激激素驱动的失调等，但缺乏统一的分子机制解释。
既往研究已证实SARS-CoV-2可进入胰腺，且胰腺外分泌组织常受累，而内分泌受累可能呈局灶性和情境依赖性。多个研究（包括研究人员前期工作）支持年龄是体内胰腺易感性的主要调节因素——在可比病毒暴露条件下，老年非人灵长类（NHP）比成年个体表现出更严重的胰岛病理。然而，将病毒暴露转化为进行性胰岛衰竭的近端分子触发因素仍不清楚。
β细胞的核心脆弱性在于胰岛素颗粒生物发生和肽激素共包装过程中的蛋白质稳态应激。胰岛淀粉样多肽（IAPP；胰淀素）与胰岛素共分泌，可错误折叠为寡聚体和原纤维；毒性IAPP寡聚体与糖尿病进展中的β细胞功能障碍和丢失密切相关。虽然宿主因素影响IAPP错误折叠已知，但病毒结构蛋白能否直接结合宿主内分泌肽并在体内催化淀粉样组装尚未确立。呼吸道病毒物理性互作、劫持并恶意加速宿主内分泌激素聚集的假说，建立了连接病毒学与淀粉样变性病的多系统致病范式。近期突破性研究表明SARS-CoV-2可在离体人视网膜外植体和脑类器官中加速淀粉样蛋白-β（Aβ）病理，产生类似阿尔茨海默病的病理特征。尽管中枢神经系统（CNS）研究已取得进展，但解析内分泌系统中病毒介导的直接淀粉样变性病与旁观者损伤的相对贡献仍极具挑战性。
二、研究内容与核心发现
本研究提出一个统一的多层次机制框架，阐明SARS-CoV-2如何诱导终末内分泌衰竭。利用老年和成年恒河猴组织、计算机界面建模、定量结合实验以及β细胞/原代人源化IAPP（hIAPP）转基因小鼠胰岛模型系统，研究人员定义了连接刺突蛋白/核衣壳蛋白-IAPP结合与淀粉样沉积、补体/炎症激活以及胰岛素颗粒成熟和运输受损的病毒-宿主互作轴。研究引入5氨基酸突变体表面等离子体共振（SPR）测定和硫黄素-T（ThT）聚集动力学，证明病毒刺突蛋白和核衣壳蛋白的直接成核能力。利用高分辨率空间多组学、三重标记原位杂交（鉴定活性反义病毒复制）和绝对超微结构定量，定义了“物理缠绕”模型——病毒播种的IAPP纤维网机械性捕获前胰岛素货物并隔离关键膜运输机器。这些发现将COVID-19后代谢疾病重新定义为病毒加速的、机械驱动的淀粉样变性病，为临床干预提供精确分子靶点。
三、关键技术方法
研究人员综合运用以下关键技术：老年和成年恒河猴SARS-CoV-2感染模型及组织病理学分析（H&E染色、IAPP免疫染色、硫黄素S染色）；多重全景免疫荧光和多重荧光原位杂交（FISH）检测病毒正义/反义RNA与IAPP共定位；透射电子显微镜（TEM）超微结构定量分析；AlphaFold3分子对接和GMX-MM-PBSA结合能计算作为假设生成工具；免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱（MS）验证直接蛋白互作；5氨基酸突变体SPR结合动力学测定；ThT聚集动力学和负染TEM评估淀粉样加速效应；MIN6β细胞系和hIAPP转基因小鼠原代胰岛的离体功能验证（GSIS/KSIS、细胞活力、EV分析）；激光捕获显微切割结合LC-MS/MS空间蛋白质组学；邻位连接分析（PLA）；qPCR和免疫印迹验证基因和蛋白表达变化。
四、研究结果
老年感染与灵长类胰岛中广泛IAPP淀粉样沉积和胰岛素丢失相关：老年感染猴胰岛中观察到显著嗜酸性淀粉样沉积，IAPP免疫染色和硫黄素S染色阳性。定量分析显示老年感染组IAPP阳性胰岛比例高达88.91%，而成年组为零。感染老年组呈现两种病理表型：肿胀退行性β细胞伴索状结构和周细胞IAPP表达，以及严重β细胞丢失伴致密IAPP阳性淀粉样斑块填充间质空间。多重免疫荧光显示感染后胰岛素?IAPP?双阳性β细胞比例从0.42%显著升至3.61%，淀粉样IAPP纤维面积达5.59%，广泛分布于胰岛并取代α和β细胞。
SARS-CoV-2 RNA和蛋白信号与IAPP聚集体共定位，诱导超微结构病理和β细胞坏死性凋亡：TEM显示老年感染β细胞胞质高电子密度纤维物质、细胞间隙增宽、大量未结合囊泡结构以及电子致密胰岛素颗粒耗竭。定量形态学分析显示成熟胰岛素颗粒密度下降超过80%，未成熟颗粒或空“幽灵囊泡”增加近三倍。多重FISH检测到老年感染胰岛中正义和反义病毒RNA信号增加，0.072%的反义RNA阳性复制灶与IAPP阳性斑块区域重叠。寡聚体特异性抗体检测到IAPP寡聚体仅存在于感染老年胰岛中，部分与病毒刺突蛋白信号共定位。磷酸化MLKL（p-MLKL）和磷酸化RIP3（p-RIP3）免疫荧光显示老年感染胰岛中坏死性凋亡标志物大幅上调，证实病毒播种的IAPP寡聚体/淀粉样变性病触发RIP3/MLKL介导的坏死性凋亡通路。
刺突蛋白和核衣壳蛋白直接结合proIAPP并经正交实验验证：AlphaFold3和互补对接作为假设生成工具，提名proIAPP与刺突蛋白或N-CTD之间的候选接触表面。Co-IP实验证实IAPP与刺突蛋白和核衣壳蛋白均存在特异性互作，质谱分析确认IAPP复合物中存在29个刺突蛋白独特肽段和20个核衣壳蛋白独特肽段。
刺突蛋白和核衣壳蛋白通过离散界面结合proIAPP并加速IAPP淀粉样动力学：基于对接界面理性设计5氨基酸突变体[R44A/I59A/S62A/T69A/Y70F]。SPR显示野生型IAPP与两种病毒蛋白呈低微摩尔范围高亲和力结合（S-IAPP KD：7.53E-06 M；N-IAPP KD：8.89E-05 M），而突变体完全消除结合。ThT动力学显示刺突或核衣壳蛋白的引入几乎消除滞后相，荧光强度在数分钟内呈指数飙升，TEM证实IAPP+刺突/核衣壳共孵育产生巨大、超致密且高度缠绕的大分子纤维网。
IAPP-病毒互作损害β细胞胰岛素储存并削弱刺激诱发分泌，同时驱动不成比例的EV释放：MIN6细胞实验中，IAPP+刺突和IAPP+N-CTD组合显著降低细胞活力（CCK-8降至对照的29.2%-33.1%）并增加LDH释放。两种递送模式下IAPP与病毒蛋白共存均消耗胞内胰岛素（降至对照的50.9%-57.9%）。GSIS和KSIS均显著下降，总分泌AUC降至对照的35.1%-43.2%。EV胰岛素货物在IAPP+N-CTD组选择性耗竭，所有处理组释放约10倍于对照的EV颗粒但胰岛素包装不足。
SARS-CoV-2刺突/N蛋白在离体人IAPP转基因胰岛中加剧β细胞功能障碍：hIAPP转基因小鼠原代胰岛中，PLA实验直观确认病毒蛋白与IAPP在<40 nm范围内的直接细胞内结合。慢病毒递送刺突蛋白使GSIS降低约40%，N-CTD降低约78%；KSIS呈类似趋势。蛋白暴露实验重现相同方向。DIA蛋白质组学显示“胰岛素分泌”“SNARE囊泡运输互作”“内吞”和“补体与凝血级联”为最显著改变通路，凝血因子X（F10）为共享差异蛋白并经免疫印迹验证。
SARS-CoV-2感染重编程老年灵长类胰岛蛋白质组：补体激活和胰岛素囊泡运输受损：激光捕获显微切割结合LC-MS/MS空间蛋白质组学显示感染后184个蛋白上调和580个下调。PPI网络分析鉴定四个簇：核糖体/抗原呈递、剪接体、补体与凝血、SNARE囊泡运输。KEGG富集分析显示补体与凝血级联在上调蛋白中显著富集（14个补体相关蛋白升高，包括C1q、C1s、C2、C4BPA、CFB、CFH、C3、C8、C9），而ER蛋白加工、内吞和SNARE囊泡运输在下调蛋白中富集（GOSR1、STX18、STX2、VAMP4、VAMP7、VAMP8六个关键SNARE蛋白下调）。胰岛素受体（INSR）显著下调（log?FC=-7.45），形成“双重打击”。胰岛与血清蛋白质组比较鉴定13个共享差异蛋白，多为补体相关。
感染胰岛微环境中的补体系统激活和炎症反应：多重免疫荧光验证C4BPA、HPX和铜蓝蛋白在感染老年胰岛中显著升高，且HPX?IAPP?和铜蓝蛋白?IAPP?双阳性细胞显著增加。ER应激标志物GRP78和炎症因子IL-6、TNF-α在感染老年组显著上调，CHOP?IAPP?、GRP78?IAPP?、IL-6?IAPP?和TNF-α?IAPP?双阳性细胞均显著增加。MIN6和hIAPP转基因胰岛中IAPP与病毒蛋白共存均升高IL-6和TNF-α，最强诱导见于IAPP+N-CTD（IL-6）和IAPP+刺突（TNF-α）条件。
空间蛋白质组学将IAPP病理与囊泡运输破坏联系起来：Pathview映射显示VAMP4、VAMP7和VAMP8等关键囊泡相关蛋白广泛抑制。TEM显示感染β细胞中胰岛素颗粒显著减少，许多仅存单层膜而无致密核心的颗粒“幽灵”。多重免疫荧光显示Rab5和VPS35表达显著降低，VAMP4/VAMP8分布改变。qPCR和免疫印迹显示胰岛素mRNA（Ins1和Ins2）停滞，伴随运输/胞吐转录本（Rab5a、Vps35、Vamp4、Vamp2、Vamp8、Stx1a、Stx2、Stx4、Stxbp1）的代偿性上调，但胰岛素前体蛋白积累，与颗粒成熟/加工受损一致。
五、研究结论与意义
该研究确立了SARS-CoV-2结构蛋白作为IAPP组装的致病性“种子”的新机制，建立了“IAPP聚集-颗粒成熟受损-补体激活-囊泡运输阻断”轴，解释了COVID-19后糖尿病年龄相关易感性的分子基础。研究将COVID-19后代谢疾病重新定义为病毒加速的、机械驱动的淀粉样变性病，为临床干预提供了精确分子靶点，包括病毒-IAPP界面口袋（Pocket 1-4）作为潜在药物设计位点。该论文发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
