Indole-1,2,4-triazole Mannich杂合体作为双重抗新城疫病毒（NDV）基因VII D型与抗菌剂：in ovo有效性和计算分析

《Scientific Reports》：Indole-1,2,4-triazole mannich hybrids as dual anti-newcastle disease virus genotype VII D and antimicrobial agents: In ovo efficacy and computational profiling

　　

新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）仍是全球家禽生产的主要威胁，尤其当病毒暴发被继发性微生物感染加重时。为应对该挑战，研究人员设计并合成了一系列聚焦的吲哚–1,2,4-三唑 Mannich 杂合体（4a–d、5c–d、6a–d、7a–d 和 8a–b），作为潜在的双重抗病毒–抗菌剂。合成化合物的结构经IR、¹H NMR、¹³C NMR和质谱确证。使用无特定病原体（specific pathogen-free, SPF）鸡胚进行in ovo抗病毒评价，显示对NDV基因VII D型复制具有显著抑制。未处理病毒表现出高血凝（hemagglutination, HA）滴度（10^8·6），而最活跃化合物处理使滴度降至约10^4·1–10^4·8，其中化合物7c表现出与参比药物利巴韦林（10^4·1）相当的活性。抗病毒效力得到有利抑制和选择性参数进一步支持，最活跃衍生物的半数抑制浓度（IC₅₀）处于低微摩尔范围，治疗指数（therapeutic index, TI）接近或超过100，表明强抗病毒效力且细胞毒性有限。除抗病毒活性外，若干化合物对革兰阳性、革兰阴性和真菌病原体表现出广谱抗菌作用。值得注意的是，对金黄色葡萄球菌观察到强抑制（抑菌圈达38 mm），同时对副鸡嗜血杆菌和鼠伤寒沙门菌有显著活性（分别达25 mm和20 mm）。所选衍生物还表现出抗白色念珠菌活性，部分接近参比抗真菌剂疗效。针对重组NDV血凝素–神经氨酸酶（hemagglutinin–neuraminidase, HN）蛋白神经氨酸酶结构域的机制研究鉴定化合物5d和7c为强抑制剂，其IC₅₀分别为1.375 ± 0.03和3.343 ± 0.09 μM，支持干扰HN介导的病毒进入作为可能的抗病毒机制。针对NDV HN（PDB：1USX）的分子对接，辅以计算机模拟（in silico）吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）分析，进一步合理化配体–蛋白相互作用，并突出先导化合物的良好药代动力学特征。总体而言，这些发现确定吲哚–三唑 Mannich 杂合体为有前景的双重作用支架，能够抑制NDV基因VII D型复制，同时靶向机会性微生物共感染，为禽类健康管理中整合抗病毒和抗菌疗法的进一步优化提供合理平台。

本研究围绕新城疫（Newcastle disease, ND）持续威胁家禽生产、疫苗接种后仍可发生田间暴发和排毒，以及常伴继发细菌/真菌感染加重病情的问题展开。新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）的吸附和传播依赖多功能表面糖蛋白血凝素–神经氨酸酶（hemagglutinin–neuraminidase, HN），其介导唾液酸化受体结合、神经氨酸酶活性促进释放并与融合蛋白协同促进膜融合，因此HN被视为可成药枢纽。吲哚和1,2,4-三唑是常用药理学杂环，研究人员先前报道吲哚–1,2,4-三唑杂合体为选择性ERK抑制剂，基于此设计Mannich杂合体，以期增加相互作用能力、改善理化行为并保留关键药效团。

关键技术方法：研究人员以吲哚-3-丙酸和硫代碳酰肼经一锅融合得到关键中间体，再与取代苯甲醛缩合得Schiff碱，随后与甲醛和二级胺经Mannich反应构建目标杂合体，并用IR、¹H NMR、¹³C NMR和质谱表征。样本来源包括：NDV基因VII D型、标准菌株和灭活疫苗来自Central Laboratory of Veterinary Biologics（CLEVB），Cairo，Egypt；SPF鸡胚和1日龄SPF鸡来自National Project for Production of Specific Pathogen-Free Eggs，Koum Oshim，Fayoum，Egypt。抗病毒在SPF鸡胚（SPF-ECEs）中测定半数细胞毒性浓度（CC₅₀）、IC₅₀、TI和HA滴度；神经氨酸酶抑制用荧光微板底物裂解试验，重组NDV HN神经氨酸酶域蛋白，oseltamivir carboxylate为对照；抗菌用琼脂纸片扩散；分子对接用MOE-Dock v2024.0601和PDB 1USX；ADMET用SwissADME/pkCSM；密度泛函理论（DFT）用ORCA。

研究结果：
化学：中间体5-(2-(1H-indol-3-yl)ethyl)-4-amino-4H-1,2,4-triazole-3-thiol（2）经一锅融合得到，与取代苯甲醛缩合得3a–e，再经Mannich得4–8。IR、NMR和质谱证实保留吲哚–三唑骨架、CH=N和N–CH₂，以及C=S等；Schiff碱产率76–84%，Mannich产物产率55–85%，取代基和胺的影响并非单一电子效应。

生物学评价：
in ovo抗病毒评价：在SPF-ECEs中评价对NDV基因VII D型作用；所有化合物低胚胎毒性；7c和7d安全窗最宽，超过利巴韦林。
IC₅₀、CC₅₀和治疗指数：CC₅₀为>300至>600 μL/egg；IC₅₀为≤3.1至≤9 μg/mL；5d最强（≤3.1 μg/mL），与利巴韦林相当；4b、4c、7a、7b、7c、7d为≤6 μg/mL；TI按保守最小估计；7c和7d的TI≥100，超过利巴韦林TI≥96；5d的TI≥96。
HA滴度降低证实in ovo病毒活性抑制：未处理病毒HA滴度为10^8·6，处理组降至10^4·1–10^4·8；7c降至10^4·1，与利巴韦林相同；4b、4c、5d、7a、7b、7d、8b为10^4·3–10^4·8；6a、6b、4a最弱。该评价仅限NDV基因VII D型。
神经氨酸酶抑制将先导化合物与机制靶点关联：5d的IC₅₀=1.375 ± 0.03 μM，7c=3.343 ± 0.09 μM，7d=24.56 ± 0.68 μM；oseltamivir carboxylate=0.801 ± 0.02 μM；顺序为oseltamivir carboxylate>5d>7c>>>7d；5d为机制支持的主要先导，7c为后备，7d的N-甲基化不利。
抗病毒构效关系：Mannich氨基烷基片段为活性所必需，叔胺影响溶解度、质子化和静电作用。4-氯系列活性为4b≈4c>4d>4a；4-甲氧基系列5d最优；4-羟基-3-甲氧基降低抗病毒活性；3,5-二甲氧基系列7c和7d TI最高；3,4,5-三甲氧基未进一步提高。
抗菌活性：琼脂纸片扩散对S. aureus、S. avium、H. paragallinarum、S. typhimurium和C. albicans。革兰阳性抑制强，6a为38 mm、4a为36 mm、6b为34 mm对S. aureus，达到或超过ampicillin的33 mm；S. avium中4a为35 mm、6a为32 mm、6b为36 mm，超过ampicillin的30 mm。革兰阴性多数较弱，但7c和7d对H. paragallinarum为23和25 mm，对S. typhimurium为19和20 mm，接近ampicillin的26和21 mm。抗真菌中4d和7c为22 mm，4b和6d为21 mm等，接近nystatin的24 mm。当前为抑菌圈筛选，MIC后续研究；双效益先导包括革兰阳性强的4a/6a/6b和革兰阴性覆盖较好的7c/7d。

计算研究：
分子对接模拟：MOE-Dock，PDB 1USX，Neu5Ac重对接RMSD为0.76 ?，能量?10.24 kcal/mol；参考配体与Arg174、Arg416和Arg498作用。5d、7c、7d对接分数为5d（?9.97）>7c（?9.14）>>7d（?7.61 kcal/mol），与酶抑制一致。5d和7c与Arg174经三唑N?1氢键作用，距离3.35和3.05 ?；5d还与Arg416及iminomethyl N形成3.47 ?氢键；7d结合姿态较差。
药物类似性和ADMET分析：SwissADME/pkCSM显示5d无Lipinski/Veber违反；7c（MW=505.64 g/mol）和7d（MW=519.66 g/mol）各有一项Lipinski违反。氢键供体1–2，氢键受体5–6，可旋转键8–9，拓扑极性表面积（TPSA）98.70–116.72 ?²，MLogP 2.03–2.54；胃肠吸收较好，血脑屏障穿透有限；均为P-gp底物和抑制剂。水溶性log S为?3.897至?4.264；人肠道吸收90.49–92.66%；5d的log BB=?0.049，7c=?1.22，7d=?1.245；为CYP2D6和CYP3A4底物；5d有较广CYP抑制；Ames阴性，hERG I非抑制但hERG II抑制，预测有肝毒性，无皮肤致敏。
DFT研究：ORCA，B3LYP-D4/def2-SVP/RIJCOSX。HOMO为5d ?6.931 eV、7c ?5.843 eV、7d ?6.933 eV；LUMO为?0.952、?1.091、?1.092 eV；能隙支持软化学和结合柔性。偶极矩7.591–7.894 D；亲电指数7d为2.7533 eV，5d为2.600 eV，7c为2.529 eV。HOMO位于吲哚及乙基间隔，LUMO位于1,2,4-三唑-3-硫酮和取代芳亚肼段；MEP负电区集中在C=S硫和甲氧基氧，正电区在吲哚N-H及7c哌嗪N-H。
整合先导优化：5d为效力基准，7c和7d选择性最大；神经氨酸酶区分5d>7c>>>7d，para-methoxy和游离哌嗪NH为靶点结合关键；7c和7d革兰阴性抗菌较优；ADMET支持继续开发；5d为主要机制验证抗病毒先导，7c为平衡双活性候选，7d为结构信息比较物。

讨论部分指出，双重抗病毒和抗菌活性主要由共享药效团需求驱动，取代基电子效应细调各靶点效力；核心杂环提供疏水和氢键，芳基电子调节脂溶性和电子密度，并得到DFT支持。结论翻译：本研究提供一个连贯的、机制支持抗感染发现包，理性支架设计、验证合成、正交生物测定和结构引导计算收敛于明确先导优先级。吲哚–1,2,4-三唑框架的Mannich多样化产生聚焦系列，成功构建和官能团完整性由一致表征支持。在SPF鸡胚中，多个衍生物，尤其5d、7c和7d，表现出针对in ovo NDV基因VII D型的强抗病毒活性和低胚胎毒性，由良好CC₅₀/IC₅₀/TI值及HA滴度显著抑制支持。抗菌面板显示对革兰阳性、革兰阴性和真菌病原体的菌株依赖性但有意义活性，支持该支架对NDV基因VII D型和家禽相关继发感染的双重效益控制价值。神经氨酸酶抑制和对接将活性观察转化为结构优先级，顺序为oseltamivir carboxylate>5d>7c>>>7d；5d因顶级in ovo抗病毒效力（IC₅₀≤3.1 μg/mL；TI=96.77）、最强神经氨酸酶抑制（IC₅₀=1.375 ± 0.03 μM）和最一致对接支持而成为最佳整体先导；7c为有价值后备，7d为SAR定义比较物。SwissADME/pkCSM支持先导集可行类药理化空间，同时提示开发性和安全性标志。未来研究将评估更多NDV毒株并探索动态in silico稳定性。