共进化肽–GPCR系统感知宿主进入并驱动真菌感染：Ustilago maydis中Pit2衍生肽激活Gpe1的结构与功能机制

《Nature Communications》：A co-evolved peptide-GPCR system senses host entry to drive fungal infection

成功的感染需要病原体识别特定宿主环境，从而相应地重编程其生理。真核细胞感知周围环境的一种主要方式是通过G蛋白偶联受体（GPCRs），其共享七次跨膜结构以及G蛋白介导的下游信号传导。哺乳动物GPCRs已被充分表征并代表重要药物靶点，而真菌中的对应物仍了解甚少。在此，研究人员揭示了一种基于GPCR的机制，使玉米病原体Ustilago maydis能够感知其是否已进入植物组织。在感染过程中，真菌分泌蛋白Pit2，该蛋白被宿主质外体半胱氨酸蛋白酶（apoplastic cysteine proteases）切割，释放隐藏于蛋白核心内的肽配体。该配体激活真菌GPCR Gpe1，从而在初始宿主穿透后促进真菌增殖。研究人员阐明了Pit2的晶体结构，并模拟了Gpe1与Pit2衍生肽形成的复合物。结构指导的突变分析支持破坏该相互作用会降低真菌毒力。Gpe1/Pit2系统在相关真菌物种中保守，共进化特征显然维持了受体-配体特异性。此外，该系统与哺乳动物受体显示机制相似性，提示真菌与哺乳动物GPCRs之间存在进化联系。

研究背景与问题：病原真菌需识别宿主特异性环境并重编程生理。真核细胞感知环境的主要途径之一是G蛋白偶联受体（GPCRs，七次跨膜信号受体），其具七次跨膜（7TM）结构和G蛋白介导下游信号。哺乳动物GPCRs研究充分且是重要药物靶点，但真菌GPCRs的配体与激活机制认识不足。Ustilago maydis是玉米黑粉菌和植物-病原互作及真菌发育模型，生活史含酵母样阶段和侵染菌丝，菌丝发育与宿主信号检测协调。已知效应子Pit2由宿主木瓜样半胱氨酸蛋白酶（PLCPs，植物免疫相关蛋白酶）加工释放抑制PLCP的肽；pit2与pit1连锁，pit1编码预测跨膜蛋白但功能未知，缺失表型相似。尽管GPCR信号重要，U. maydis中经典GPCR未被研究。因此研究人员开展本工作。该论文发表于《Nature Communications》。

关键技术方法：研究人员基于AlphaFold2和Foldseek在U. maydis全蛋白组搜索7TM候选；改造S. cerevisiae JTy014报告菌株检测GPCR激活及肽分泌；HPLC分离和质谱鉴定Pit2肽；重组表达纯化Pit2，X射线晶体学解析结构；AlphaFold3建模与FoldMason多结构比对；构建gpe1变体进行玉米感染；微流控活细胞成像和qRT-PCR；共进化分析使用HMMER、MUSCLE、IQ-TREE。玉米品种Zea mays cv. Early Golden Bantam (EGB)用于感染；U. maydis、S. reilianum、U. hordei序列来自FungiDB。

研究结果：
1. GPCR Gpe1被Pit2衍生肽激活。通过全基因组7TM搜索鉴定34个候选并聚焦UMAG_01374，重命名为Gpe1。Gpe1为435 aa，含短N端和长无序C端，第二细胞外环（ECL2）通过Cys¹⁷⁸-Cys¹⁰⁸二硫键连接。酵母报告显示全长Pit2激活较弱，胰蛋白酶消化后低十倍浓度达约100%。质谱鉴定11 aa肽WWFGFTGSLGK，核心WWFGFTGSL（Pit2.5）最强，N端RR抑制。结论：Gpe1是Pit2衍生肽的受体，激活依赖宿主PLCP加工。
2. Pit2作为Gpe1激活肽的支架。Pit2分泌全长，尺寸排阻色谱（SEC）单分散，晶体结构2.3 ?，51-120残基形成五β链一α螺旋同源二聚体，激活肽WWFGFTGSL位于β1并埋于二聚体界面。结论：Pit2在宿主切割前保护并隐藏激活肽，防止Gpe1过早激活。
3. Gpe1保守残基对Pit2肽结合必需。AlphaFold3预测肽N端W埋入TM1/ECL2腔。EC₅₀为80 nM；N端疏水替换显著降低，W01A消除。Gpe1变体F30A/I41A中等影响，C178A和W37A几乎无响应。玉米感染中，gpe1/pit2缺失几乎无毒力，gpe1和gpe1^F30A恢复野生型，I41A略降，C178A/W37A强减毒。结论：结构指导突变验证结合界面与毒力相关。
4. Pit2介导Gpe1激活诱导受体内吞并促进增殖。Gpe1-G在SG200中加肽后快速内吞，主要至液泡降解。细胞分裂周期从226±40 min降至167±10 min。qRT-PCR显示Gpe1表达降低交配型通路基因但clp1约5倍升高，Pit2肽进一步升高Gpe1背景clp1，未折叠蛋白反应（UPR）标记不受影响。结论：Gpe1激活优先促clp1表达，连接宿主肽感知与增殖再启动。
5. Gpe1/Pit2在黑粉菌中显示共进化特征并与哺乳动物视紫红质受体相似。Gpe1同源物广泛，Pit2仅近缘；激活肽残基保守。SrPit2激活UmGpe1类似UmPit2，UhPit2不激活；UmPit2/SrPit2弱激活UhGpe1。Foldseek发现担子菌GPCR及DUF6533，Paxillus rubicundulus同源TM-score 0.8，r.m.s.d. 4 ?。FoldMason识别三个保守簇，包括TM1-TM2-TM7、TM1-TM7和TM3-TM6中R^3.50与N246/N247，类似离子锁。N246D+N247G降低激活，N246L+N247L和R133A消除。结论：该受体家族保守，Gpe1含与rhodopsin/class A GPCR相似的激活模块。

讨论与结论：讨论部分指出，Gpe1/Pit2是宿主依赖的肽–GPCR信号系统，通过宿主蛋白酶活性识别植物环境。PLCPs在植物免疫中核心且感染胁迫诱导；该系统劫持PLCP，切割产生不同肽，分别抑制PLCP或激活Gpe1促增殖，可能平衡免疫抑制与植物内真菌增殖。未来需研究两种肽在U. maydis感染中的各自贡献。研究还扩展了真菌肽基通讯系统：与内源信息素交配系统不同，Pit2隐藏肽释放依赖宿主。类似宿主门控信号模块可能在病原和共生真菌中更广泛。进化上，真菌可能反复征用蛋白酶加工短肽作为GPCR配体。探索真菌谱系肽-GPCR对可能揭示整合真菌生活阶段、微生物群落和宿主环境的隐藏通讯网络。

研究结论翻译：总之，研究人员的工作在黑粉菌中鉴定了一个宿主依赖的肽–GPCR信号系统，通过宿主蛋白酶（host proteases）的蛋白水解活性介导真菌对宿主特异性植物环境的识别。植物中有数百种蛋白酶调控中心发育程序，近期研究强调其在免疫中的核心作用。尤其，木瓜样半胱氨酸蛋白酶（PLCPs）广泛保守，并在病原体感染和胁迫时在不同植物组织中常被强烈诱导。因此，Gpe1/Pit2系统劫持了植物免疫的一个中心且不可或缺的方面，可能在植物内平衡免疫抑制与真菌增殖。PLCP切割产生不同肽种类，这些肽要么抑制PLCP活性，要么激活Gpe1以促进真菌增殖，支持上述观点。未来工作需研究这两种肽版本在U. maydis感染过程中的各自贡献。