基于单细胞BCR与转录组学分析鉴定针对HAdV-4感染的高效中和抗体

《International Journal of Molecular Sciences》：Single-Cell BCR and Transcriptome Analysis Revealed Potent Neutralizing Antibodies in Response to HAdV-4 Infection

人腺病毒4型（HAdV-4）是引起急性呼吸道感染的主要血清型之一，目前尚无获批临床应用的抗体药物，存在迫切的未满足医疗需求。本研究旨在通过解析感染后的B细胞免疫应答，鉴定高效的中和抗体，从而为疫苗设计与抗病毒治疗奠定基础。研究人员从16名HAdV-4康复志愿者中筛选出其中和抗体滴度最高的个体，分离其外周血单个核细胞（PBMCs）。共从该患者外周血中分选获得2710个B细胞，并通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与单细胞VDJ测序（scVDJ-seq）技术，全面分析了B细胞亚群特征及B细胞受体（BCR）库。随后，基于BCR特征及其来源，筛选候选抗体进行一系列功能与机制验证。转录组分析将记忆B细胞分为三个功能异质性亚群，分别命名为MB sub1、sub2与sub3。结合BCR特征，研究人员从sub2与sub3中选取92个抗体进行合成及进一步功能验证。成功鉴定出三株高效中和抗体，其中1QH7在体外展现出强效病毒中和能力，并在Stat1基因缺陷小鼠模型中提供显著的体内保护效果。研究人员进一步利用AlphaFold 3预测了1QH7与HAdV-4六邻体蛋白（Hexon protein）的复合物结构，并通过定点诱变验证了关键结合残基。此外，研究阐明了由TRIM21介导的病毒中和机制。本研究建立了一种基于scRNA-seq与scVDJ-seq整合分析的高效抗体筛选策略，并分离出一株高效中和抗体1QH7，为新型突发传染病暴发时快速开展非病原体诱饵依赖、细胞亚群引导的抗体筛选路径奠定了坚实基础。

研究背景与意义

人腺病毒4型（HAdV-4）是一种全球流行的呼吸道病原体，是引起急性呼吸道感染的主要血清型之一。婴幼儿、儿童及免疫功能低下者更易感，部分病例可进展为重症肺炎甚至死亡。近年来，HAdV-4在普通社区人群中的检出率显著上升。一项来自广州儿童医院的回顾性研究显示，在1988年至2005年间死于肺炎的儿童肺组织样本中，HAdV-4占所有腺病毒阳性病例的比例高达75%，提示其可能是导致儿童致死性肺炎的关键血清型。然而，目前尚缺乏针对HAdV-4的特异性抗病毒药物及获批用于普通人群的疫苗，临床治疗仍以支持性护理为主。因此，开发高效安全的特异性抗病毒策略是一项迫切且未满足的临床需求。

传统中和抗体筛选方法通量低、耗时长，依赖对大量克隆的逐一验证，通常需要数月时间，难以应对新型或突发传染病的快速响应。单细胞测序技术的突破性进展为高效抗体筛选提供了新的解决方案。基于微流控平台，单细胞测序技术能够高通量并行捕获数万个单个B细胞的转录组和VDJ序列，实现自动化BCR配对，将抗体发现周期从数月缩短至数天。当与生物信息学深度挖掘B细胞库多样性相结合时，可为快速锁定具有特定表达特征或突变模式的候选抗体提供强大工具。

本研究旨在建立一种整合单细胞测序与功能验证的抗体发现策略，从HAdV-4康复供体中鉴定高效中和抗体，为疫苗设计和抗病毒治疗奠定基础，同时验证基于单细胞测序的抗体发现平台在新发传染病应对中的效率与适用性。

主要关键技术方法

研究人员从16名HAdV-4康复志愿者中筛选出中和抗体滴度最高的供体，分离其外周血单个核细胞（PBMCs），经流式细胞术分选出2710个B细胞。采用10x Genomics平台的单细胞RNA测序（scRNA-seq）与单细胞VDJ测序（scVDJ-seq）技术，同步获取B细胞的转录组与BCR序列信息。通过整合分析，对B细胞亚群进行分类与注释，并基于BCR的V-J基因组合特征及体细胞高频突变（SHM）水平，从记忆B细胞亚群中筛选候选抗体进行合成与功能验证。体内保护实验采用Stat1基因缺陷小鼠模型进行攻毒实验。抗原-抗体复合物结构通过AlphaFold 3进行预测，并结合定点诱变进行关键结合残基验证。

研究结果

2.1 单细胞转录组图谱揭示B细胞异质性景观

研究人员通过无监督聚类和细胞类型注释，将2710个B细胞划分为11个细胞簇，包括初始B细胞（25.35%）、浆细胞（23.28%）、记忆B细胞（47.08%）及其他细胞（4.28%）。记忆B细胞被进一步分为三个转录组学上不同的亚群：MB sub1（44.28%）、MB sub2（22.49%）和MB sub3（33.23%）。差异表达基因分析和基因本体论（GO）富集分析显示，三个亚群功能各异：MB sub1可能主要参与免疫监视；MB sub2代表中间或过渡状态，可能在免疫调节中发挥作用；MB sub3则准备分化为浆细胞，主要参与抗体分泌的准备。伪时间轨迹分析进一步证实了这一分化顺序，MB sub1分布于初始分支段，而sub2和sub3位于终末分支段。

2.2 不同B细胞群体中BCR免疫库的特征

研究人员鉴定了1972个全长配对BCR。浆细胞主要表达IGHM（97.62%），而记忆B细胞同时表达IGHA（27.74%）、IGHM（30.25%）和IGHG（31.66%）。三个记忆B细胞亚群表现出不同的抗体同种型表达谱：MB sub1主要表达IGHM，而MB sub2和sub3主要表达IGHG。MB sub2和sub3的SHM水平显著高于MB sub1，且MB sub2的CDR3长度显著长于MB sub1和MB sub3。BCR多样性分析显示，MB sub2的香农指数显著高于MB sub1，表明sub2可能含有sub1和sub3中缺失的稀有克隆。这些结果表明MB sub2更可能包含通过亲和成熟富集的高亲和力抗体。

2.3 中和抗体在记忆B细胞亚群中的定位

研究人员依据MB sub2或sub3中CDR长度或SHM水平高于sub1的标准，选择了特定的重链V-J基因组合，合成了源自MB sub2和sub3的92个抗体序列。酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定出5株对六邻体蛋白（Hexon）具有高结合活性的单克隆抗体，EC₅₀值均低于30 ng/mL。假病毒中和试验显示，1QH7、1AG5和3WS9三株抗体具有强效中和活性，IC₅₀值均低于50 ng/mL，其中1QH7最为强效（IC₅₀=5.31 ng/mL）。真实病毒中和试验进一步确认了1QH7对HAdV-4的中和能力。竞争ELISA和AlphaFold 3预测的结构模型表明，这三株抗体结合六邻体蛋白的不同区域。表面等离子共振（SPR）测定显示1QH7与六邻体蛋白具有高亲和力结合（KD=5.88 nM）。差示扫描量热法（DSC）显示其具有良好的结构稳定性。1QH7对HAdV-5和HAdV-7无交叉中和活性，证实其严格的血清型特异性。

2.4 1QH7在Stat1缺陷小鼠模型中保护免受HAdV-4攻击

在Stat1基因缺陷小鼠模型中，预防性给予1QH7（2 μg、10 μg或50 μg）24小时后进行攻毒，结果显示剂量依赖性地提高了生存率和体重恢复。10 μg剂量在预防和治疗方案中均提供完全保护。攻毒后3天收集的组织病毒载量分析显示，预防组和治疗组的肺和肝脏病毒拷贝数均显著低于病毒对照组。病理学检查显示，抗体处理组的肺部损伤明显减轻，平均综合病理评分显著低于病毒对照组。

2.5 TRIM21介导的细胞内1QH7中和机制

共聚焦显微镜观察显示，内化的抗体-病毒复合物与内源性TRIM21存在显著共定位。在TRIM21敲低或过表达的细胞中进行假病毒中和试验，结果显示TRIM21敲低减弱了抗体介导的中和作用，而TRIM21过表达增强了这一活性。进一步的共定位分析显示，K48连接的泛素链被特异性招募到抗体-病毒复合物上。此外，使用泛素化通路抑制剂显著降低了抗体的中和活性。这些结果表明，1QH7进入细胞后被胞质受体TRIM21识别，可能通过招募K48连接泛素化系统，以泛素-蛋白酶体依赖性方式促进病毒颗粒的细胞内清除。

讨论与结论

本研究建立了一种整合单细胞测序框架，以解析针对HAdV-4感染的B细胞免疫应答。通过结合scRNA-seq和scVDJ-seq，研究人员成功以空前分辨率表征了B细胞的转录组和BCR库景观。分析不仅揭示了感染恢复后B细胞组成的变化，还识别出功能特化的记忆B细胞亚群，其中MB sub2和sub3亚群显示出与潜在中和抗体产生相关的转录特征。基于这些发现，研究人员合成了该亚群中富集的特定V-J基因组合对应的92个抗体进行表达和筛选，成功鉴定出三株中和抗体。其中，单克隆抗体1QH7在细胞和动物模型中均展现出强效中和活性。进一步整合抗原-抗体结构分析和基于共聚焦显微镜的细胞内中和共定位研究，为其作用机制提供了初步见解。此外，另外两株中和抗体可用于开发联合疗法或双特异性抗体，为未来治疗策略提供更多选择。

本研究证明，单细胞整合技术在抗体发现中具有高效性。然而，也存在一些局限性：流式细胞术分选B细胞的策略可能偏向表面BCR高表达的亚群；对单一供体的关注限制了关于胚系基因使用偏好的结论普适性。扩大供体样本量将有助于识别与中和广度相关的保守BCR特征，并推动广谱抗体的开发。