昼夜节律状态调控UVA诱导角质形成细胞铁死亡相关损伤的时序机制研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Temporal Regulation of UVA-Induced Ferroptosis-Associated Injury in Keratinocytes

　　

中文摘要翻译： 铁死亡（ferroptosis）参与紫外线（ultraviolet，UV）诱导的表皮损伤，但昼夜节律状态是否改变角质形成细胞的易感性尚不清楚。研究人员整合了人表皮转录组学分析与HaCaT角质形成细胞功能实验，比较了UVA和UVB诱导的铁死亡相关反应，并评估了其时间调控特征。两种波长均降低细胞活力，并增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）、脂质过氧化及细胞内Fe2+蓄积；ferrostatin-1（Fer-1）提供部分保护作用。UVB降低xCT和GPX4水平，且GPX4的丢失存在蛋白酶体敏感组分；而UVA主要降低GPX4，未检测到xCT的显著改变。人表皮转录组显示昼夜节律、氧化应激与铁死亡相关基因之间存在异质性的横断面关联，而纵向分析揭示NR1D1相关信号与GPX4之间存在正向时间耦合。在同步化的HaCaT细胞中，ARNTL和NR1D1呈现24小时节律性，而GPX4和SLC7A11未达到预设的节律性标准。然而，UVA诱导的细胞毒性、氧化应激、脂质过氧化及GPX4丢失在不同同步化后时间点存在差异，且在24小时最为显著。SR8278部分保留GPX4丰度，并减轻UVA诱导的活力丧失、ROS蓄积及脂质过氧化，但对Fe2+蓄积无显著影响。这些发现将昼夜节律状态与UVA诱导铁死亡易感性的时间变异相关联，并提示更广泛的时钟-氧化还原系统而非单个铁死亡效应分子的节律性表达参与了这一调控。

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一、研究背景与问题提出

昼夜节律钟协调代谢、抗氧化防御及应激反应在24小时周期内的运行，而氧化还原信号又反馈调节时钟功能。铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，由膜磷脂过氧化驱动，受铁、脂质及抗氧化代谢的调控。既往在肾及气道上皮模型中的研究提示时钟状态可改变铁死亡易感性，但具体通路因组织及损伤类型而异。角质形成细胞构成表皮的主要细胞屏障，含有自主的外周时钟，参与表皮稳态、增殖、代谢及应激适应。暴露于太阳紫外线辐射、高氧化应激并受内在时间门控调控的人角质形成细胞，是研究细胞计时是否塑造氧化性细胞损伤轨迹及抗氧化防御稳定性的关键生理模型。

xCT–GSH–GPX4轴是主要的铁死亡抑制网络。xCT（由SLC7A11编码）导入胱氨酸用于谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成，使GPX4能够中和脂质氢过氧化物。UVB可在角质形成细胞中诱导铁死亡并干扰GSH依赖性抗氧化防御，从而参与表皮炎症。值得注意的是，太阳UVA与UVB具有不同的光化学及生物学效应：UVB造成大量直接DNA光损伤，而UVA穿透更深并促进光敏氧化剂形成及脂质氧化。近期研究已将UVA诱导的损伤与NRF2/GPX4信号受损、铁过载及脂质过氧化相关联。然而，UVA与UVB是否对该轴产生不同或共同的改变仍不清楚。此外，固定的UVA刺激是否在不同同步化后状态下引发不同的铁死亡相关反应，以及昼夜节律状态是否与角质形成细胞中GPX4为中心的氧化还原防御变化相关，均属未知。研究人员据此假设：HaCaT细胞同步化后的时间状态改变其对UVA诱导铁死亡相关损伤的易感性，且该时间变异伴随GPX4为中心氧化还原防御的变化。

二、研究内容与主要结论

为验证上述假设，研究人员系统比较了UVA与UVB暴露对人角质形成细胞xCT/GPX4防御系统的不同影响，评估UVA诱导的防御损伤是否在时钟同步化后表现出时间依赖性变化，通过分析纵向人皮肤转录组提名皮肤时钟网络中的昼夜节律相关候选基因，并利用REV-ERB配体SR8278作为药理学探针，探索靶向时钟组分是否可减轻UVA诱导的GPX4耗竭及脂质过氧化。

研究得出以下主要结论：UVA与UVB均诱导HaCaT角质形成细胞铁死亡相关氧化损伤，但两者对xCT–GPX4轴的调控模式存在显著差异；人表皮转录组分析揭示NR1D1与GPX4之间存在正向时间耦合；同步化HaCaT细胞中GPX4本身缺乏可检测的基础24小时节律，但UVA诱导的损伤在不同同步化后时间点存在显著差异，以24小时最为严重；UVA选择性重构时钟及氧化还原相关基因的时间表达模式；SR8278部分保留GPX4丰度并减轻UVA相关的氧化及脂质过氧化损伤。

该研究的重要意义在于：将昼夜节律状态与UVA诱导铁死亡易感性的时间变异相关联，提示更广泛的时钟-氧化还原系统而非单个铁死亡效应分子的节律性表达参与调控，为理解皮肤UVA损伤的时间依赖性提供了新的概念框架，并提名NR1D1/REV-ERBα相关信号作为潜在的干预靶点。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：采用人永生化HaCaT角质形成细胞系（RRID:CVCL_0038，经STR鉴定及支原体检测）作为体外模型；用地塞米松（dexamethasone，100 nM，1小时）进行细胞同步化；使用UVA LED灯（365 nm，30 mW/cm²，剂量10 J/cm²）及UVB荧光灯（300–312 nm，1 mW/cm²，剂量5 mJ/cm²）进行照射；采用CCK-8法检测细胞活力、DCFH-DA荧光检测活性氧、Liperfluo荧光检测脂质过氧化、比色法试剂盒检测细胞内Fe²⁺水平；采用实时定量PCR（RT-qPCR，以RPL13A为内参）检测基因表达；采用蛋白免疫印迹（Western blotting）检测蛋白丰度；采用固定周期余弦模型（fixed-period cosinor model，周期固定为24小时）分析时间序列节律性；利用公共数据库GSE112660（219例独立供体前臂表皮横断面样本）及GSE139301（19例健康男性供体，每例4个时间点，共76个纵向表皮样本）进行人表皮转录组共表达及时间耦合分析。

四、研究结果

2.1 UVA和UVB在HaCaT角质形成细胞中诱导铁死亡相关损伤

通过剂量梯度照射实验发现，UVA和UVB均以剂量和时间依赖方式降低细胞活力。照射后1小时内ROS快速蓄积，4小时脂质过氧化显著增加，2小时细胞内不稳定Fe²⁺水平显著升高。铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1，5 μM）在非细胞毒性浓度下显著恢复细胞活力并减轻ROS蓄积及脂质过氧化，证实铁死亡相关氧化损伤参与UVA和UVB诱导的细胞损伤。

2.2 UVA和UVB对xCT–GPX4轴的差异调控

蛋白及转录水平分析显示，UVA和UVB均降低GPX4蛋白丰度，但UVB显著降低xCT蛋白而UVA对xCT影响甚微。SLC7A11 mRNA未被UVA显著降低，但存在显著的时间×波长交互作用；GPX4 mRNA被两种光谱均抑制。Fer-1部分保留UVA后的GPX4蛋白水平，并恢复UVB后的xCT及GPX4水平。蛋白酶体抑制剂MG132显著减轻UVB诱导的GPX4丢失，但对UVA后GPX4丢失影响甚微，提示UVB反应涉及蛋白酶体敏感组分。NFE2L2、SOD2和CAT mRNA均存在显著的时间×波长交互作用，UVA对NFE2L2和CAT表达的抑制较UVB更为显著。

2.3 人皮肤转录组学揭示GPX4与昼夜节律基因之间的动态时间耦合

在219例独立横断面前臂表皮样本中，预设的铁死亡相关、氧化应激及昼夜节律基因之间的相关性呈异质性。模块水平分析显示三个生物学程序之间存在可检测的关联。在铁死亡相关基因中，SAT1和ACSL4与昼夜节律基因集的平均|ρ|最高，GPX4最低；在昼夜节律基因中，RORA、NR1D2和NR1D1与铁死亡相关基因集的平均|ρ|最高。纵向供体水平分析显示，NR1D1与GPX4呈正向中位Kendall's τ，RORA呈负向中位Kendall's τ，表明与GPX4的时间共变方向相反。

2.4 同步化HaCaT细胞中GPX4缺乏可检测的基础24小时节律

地塞米松同步化诱导ARNTL和NR1D1 mRNA呈现稳健的24小时节律性表达，而GPX4和SLC7A11 mRNA未达到预设的昼夜节律性标准。蛋白水平上，BMAL1丰度在0–36小时时间过程中变化并与其mRNA表达模式大致一致，而GPX4和xCT均未呈现稳定的24小时振荡模式。

2.5 UVA诱导的HaCaT细胞损伤在同步化后时间过程中存在差异

同步化细胞在4、12或24小时接受固定剂量UVA照射。UVA在所有三个时间点均显著降低细胞活力和GPX4丰度并增加ROS蓄积和脂质过氧化。在UVA组内，24小时时细胞活力和GPX4丰度显著低于4和12小时，而DCFH-DA和Liperfluo荧光显著高于4和12小时。Fer-1部分减轻UVA诱导的细胞活力、ROS及脂质过氧化变化。UVA在所有三个时间点均显著增加细胞内Fe²⁺水平，但UVA组内4、12和24小时之间无显著差异。UVA诱导的损伤在同步化后24小时最为显著。

2.6 UVA选择性重构同步化HaCaT细胞中时钟和氧化还原转录程序的时序模式

UVA暴露与昼夜节律时钟及氧化还原相关基因的时间表达模式的基因特异性改变相关，而非节律性的普遍丧失。ARNTL、CLOCK和PER2在对照组和UVA暴露组均保持显著24小时节律性，但两组间拟合时间模式存在显著差异。NR1D1在对照组满足节律性标准但UVA暴露后未满足。氧化还原及铁死亡相关基因同样表现出基因特异性时间反应：NFE2L2仅在UVA暴露后显示节律性，而HMOX1、NQO1和ALOX15仅在对照组细胞中具有节律性。

2.7 SR8278部分减轻HaCaT细胞中UVA相关的氧化及脂质过氧化反应

SR8278（10 μM，12小时预处理）单独不显著影响细胞活力，但预处理部分减轻UVA诱导的活力丧失。SR8278降低基础REV-ERBα丰度，UVA联合SR8278处理后进一步降低。UVA降低GPX4丰度，而SR8278部分保留UVA暴露后的GPX4蛋白水平。SR8278还降低基础DCFH-DA荧光并减轻UVA暴露后的DCFH-DA及Liperfluo荧光，但对细胞内Fe²⁺蓄积无显著影响。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究确定了角质形成细胞对UVA相关铁死亡损伤易感性的时间变异，并证明该变异不能简单由单个铁死亡效应分子的节律性表达解释。UVA与UVB的比较表明，两种波长虽均汇聚于氧化及脂质过氧化损伤，但xCT–GPX4轴的伴随变化呈波长依赖性。UVA相关GPX4丢失的机制不同于UVB，不能通过外推UVB机制完全理解。人表皮转录组分析提供了昼夜节律、氧化应激及铁死亡通路在皮肤组织中交叉的基础框架，NR1D1与GPX4的正向时间共变提名NR1D1/REV-ERBα相关信号作为值得功能验证的候选通路。UVA诱导损伤在同步化后24小时最显著，而Fe²⁺水平在时间点间无差异，提示时间变异更密切关联氧化及脂质过氧化反应的变化而非差异性的Fe²⁺蓄积。SR8278的药理学效应与REV-ERBα相关信号参与UVA应激期间GPX4蛋白丰度调控的作用一致，但应置于SR8278更广泛的药理学效应中解读，提供的是REV-ERBα相关信号与GPX4依赖性抗氧化防御之间关联的药理学支持而非REV-ERBα特异性调控GPX4的确证。

研究结论：本研究提示角质形成细胞遭遇UVA的时间背景可能是其铁死亡相关损伤易感性的重要决定因素。研究结果支持一个更广泛的模型：互联的时钟与氧化还原过程的时间组织可能塑造GPX4为中心抗氧化防御应对UVA应激的能力，NR1D1/REV-ERBα相关信号是该时钟-氧化还原网络中可能影响GPX4中心反应从而影响时间易感性的候选组分。该视角将UVA相关细胞损伤的理解从单纯剂量依赖性反应扩展至时间依赖性维度，为阐明时间细胞状态如何影响皮肤抗氧化防御及应激脆弱性提供了基础。