《Molecular Cell》：Oligo(uridine) tailing and exonucleolytic decay drive 40S ribosome degradation in response to stress
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饥饿等应激条件会触发成熟40S核糖体的降解，这一过程需要大型稳定RNA-蛋白质复合物的协同分解。非典型激酶RIOK3通过结合泛素化的40S核糖体并促进rRNA降解来协调此过程，然而介导rRNA降解的具体机制和因子仍不明确。本研究发现，在饥饿应激下，RIOK3将
饥饿等应激条件会触发成熟40S核糖体的降解，这一过程需要大型稳定RNA-蛋白质复合物的协同分解。非典型激酶RIOK3通过结合泛素化的40S核糖体并促进rRNA降解来协调此过程，然而介导rRNA降解的具体机制和因子仍不明确。本研究发现，在饥饿应激下，RIOK3将末端尿苷酰转移酶（terminal uridylyl-transferase, TUT7）和外切核酸酶DIS3L2招募至40S核糖体。测序分析表明，TUT7在这些核糖体的18S rRNA 3′端添加寡聚尿苷（oligo(uridine)）尾。DIS3L2随后识别尿苷化的18S rRNA并执行3′-5′降解。研究人员鉴定出主要的降解中间体，这些中间体在迭代尿苷化和降解过程中经历进一步尿苷化。DIS3L2缺失会损害饥饿期间的18S rRNA降解，并导致尿苷化18S rRNA的积累。这些发现共同定义了人类细胞中核糖体降解的一种机制，即寡聚尿苷尾化驱动rRNA从核糖体上降解。
核糖体丰度需要精确调控以适应细胞蛋白质合成需求。应激条件下核糖体生物发生被抑制，而成熟核糖体在正常条件下虽稳定，但多种应激——包括营养匮乏、内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激和氧化应激——会诱导40S核糖体亚基的选择性降解，损失可超过细胞总40S核糖体的20%。在此类应激条件下，E3连接酶RNF10通过泛素化40S核糖体蛋白uS3和uS5标记翻译停滞的核糖体；非典型激酶RIOK3随后结合这些泛素化核糖体并促进18S rRNA降解。尽管冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）结构和测序数据提示RIOK3结合可启动18S rRNA的3′-5′降解，但介导rRNA降解的效应因子和具体机制仍属未知。rRNA高度结构化且包埋于成熟核糖体内部，难以被典型的mRNA降解途径处理，因此需要专门机制来分解这一大型稳定复合物。
研究人员通过免疫沉淀-质谱联用（immunoprecipitation-mass spectrometry, IP-MS）鉴定到RIOK3下游的关键因子，定义了饥饿条件下40S核糖体降解的完整通路：RIOK3招募末端尿苷酰转移酶TUT7至泛素化核糖体，TUT7在18S rRNA 3′端添加寡聚尿苷（oligo(U)）尾，外切核酸酶DIS3L2随后识别尿苷化18S rRNA并执行3′-5′降解。该工作首次揭示寡聚(U)尾化作为成熟核糖体rRNA降解的启动信号，论文发表在《Molecular Cell》。
研究方法主要基于以下关键技术：利用IP-MS鉴定与RIOK3野生型结合但不与降解缺陷型突变体结合的核酸酶；采用3′末端RNA测序（3′ end RNA sequencing）分析18S rRNA的寡聚(U)尾化及降解中间体；通过CRISPR/Cas9构建HEK293T基因敲除细胞系（包括ΔRIOK3、ΔTUT7、ΔTUT4、ΔDIS3L2、ΔRNF10及ΔRIOK3/ΔDIS3L2）进行功能验证；使用免疫印迹验证蛋白质相互作用和核糖体蛋白动态；结合siRNA敲低验证上游信号依赖；利用TapeStation系统测量整体18S rRNA水平变化。
RIOK3将TUT7和DIS3L2招募至核糖体（RIOK3 recruits TUT7 and DIS3L2 to ribosomes）。
通过IP-MS，研究人员发现DIS3L2是唯一与野生型RIOK3结合、但不同时结合两种降解缺陷型突变体（ΔUIM不能结合核糖体，ΔKD可结合核糖体但缺乏激酶结构域）的核酸酶；TUT7（而非TUT4）同样特异性富集于野生型RIOK3。免疫共沉淀证实，RIOK3与DIS3L2的相互作用依赖UIM、激酶结构域以及激酶结构域内ATP结合/水解关键残基。ΔUIM突变体既不能结合核糖体，也不与TUT7和DIS3L2结合，提示后者并非先在细胞质中与RIOK3形成复合物，而是直接结合经RIOK3诱导构象变化后的40S核糖体。RIOK3激酶结构域可使保护18S rRNA 3′端的核糖体蛋白eS26移位，从而暴露底物末端。RNF10敲低阻止DIS3L2和TUT7与RIOK3的关联，而去泛素化酶USP10敲低无此效果，表明RNF10介导的uS3/uS5泛素化是上述因子招募的先决条件。
RIOK3所结合核糖体中的rRNA带有3′寡聚(U)尾（The rRNA in ribosomes bound by RIOK3 contains 3′ oligo(U) tails）。
对RIOK3免疫沉淀产物进行3′末端测序显示，野生型RIOK3结合的18S rRNA 3′端存在大量非模板寡聚(U)尾，平均长约12个核苷酸，而在降解缺陷型RIOK3突变体结合的18S rRNA上几乎检测不到。测序数据还在18S rRNA螺旋28（h28）和螺旋44（h44）区域鉴定出两个野生型富集的降解中间体，二者均带有较短的非模板寡聚(U)尾，说明降解在此类结构区域减慢或暂停，并经历额外尿苷化以继续推进降解。
TUT7在饥饿条件下优先尿苷化18S rRNA（TUT7 preferentially uridylates 18S rRNA in response to starvation）。
通过过表达催化失活的DIS3L2 D383N以稳定并富集尿苷化底物，研究人员发现饥饿显著增加总RNA中18S rRNA 3′端寡聚(U)尾的水平，且该修饰在ΔTUT7细胞中完全消失，说明TUT7是18S rRNA尿苷化的主要酶。饥饿条件下rRNA的尿苷化几乎专一发生于18S rRNA；28S rRNA仅有少量短尾，5.8S和5S rRNA的3′端基本检测不到寡聚(U)尾。RIOK3或RNF10敲除消除大部分18S rRNA寡聚(U)尾，但对28S rRNA无明显影响，表明40S核糖体泛素化及RIOK3结合是TUT7被招募并尿苷化18S rRNA的主要途径。此外，TUT7敲除阻止DIS3L2与RIOK3的关联，证明TUT7生成的寡聚(U)尾是DIS3L2招募的必要信号。
DIS3L2从3′端降解尿苷化的18S rRNA（DIS3L2 degrades uridylated 18S rRNA from its 3′ end）。
在ΔDIS3L2细胞中，RIOK3结合的18S rRNA 3′端寡聚(U)尾水平升高且偏向更长尾，同时两个降解中间体及其尿苷化形式均缺失，表明DIS3L2直接从3′端切除尿苷化18S rRNA，并可能在遇到高度结构化区域时停顿或解离，使底物接受迭代尿苷化和再降解。全细胞18S rRNA水平测量显示，饥饿使野生型细胞18S rRNA减少约25%，DIS3L2敲除部分抵消此下降，而RIOK3敲除则更完全地阻断降解。降解中间体的高丰度支持DIS3L2是成熟40S核糖体中rRNA降解的主要效应因子，同时存在其他核酸酶的一定代偿作用。
讨论部分总结指出，该研究确立了一条应激条件下18S rRNA降解通路：40S核糖体经RNF10泛素化后，RIOK3结合并促成eS26移位，使TUT7能够在18S rRNA 3′端添加寡聚(U)尾，DIS3L2识别该修饰并进行3′-5′降解；降解中间体通过迭代尿苷化维持降解进程。该机制与细菌16S rRNA降解存在部分保守性，包括DIS3L2与细菌RNase R的同源关系，以及h28区域作为保守降解障碍。与TUT4/TUT7在其他底物上的功能冗余不同，18S rRNA尿苷化主要依赖TUT7，提示核糖体底物的特异性招募机制。研究人员提出，uS3/uS5泛素化与RIOK3结合构成门控机制，确保只有被标记的停滞或缺陷核糖体被清除；40S核糖体处于翻译延伸或休眠复合物状态时，18S rRNA对TUT7不可及，从而防止应激条件外发生滥用的核糖体降解。
研究结论为：饥饿等应激条件下，RIOK3将TUT7招募至RNF10泛素化的40S核糖体，TUT7在18S rRNA 3′端添加寡聚(U)尾，DIS3L2识别该信号并执行3′-5′外切降解，最终驱动rRNA从成熟40S核糖体中降解。寡聚(U)尾化是应激诱导的40S核糖体降解的关键启动机制，为理解人类细胞核糖体质量控制与应激适应提供了新框架。
