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蚊虫和蠓虫携带多种多样的病毒，但塑造其病毒组的因素仍未完全阐明。研究人员分析了2025年6月在中国云南15个采样点采集的、来自7个宿主类群的35个混合文库，采用总RNA测序、病毒注释、系统发育分析及群落分析方法。研究人员保留了1295条病毒重叠群（contig
蚊虫和蠓虫携带多种多样的病毒，但塑造其病毒组的因素仍未完全阐明。研究人员分析了2025年6月在中国云南15个采样点采集的、来自7个宿主类群的35个混合文库，采用总RNA测序、病毒注释、系统发育分析及群落分析方法。研究人员保留了1295条病毒重叠群（contigs），归入221个基于注释定义的病毒分类单元（viral taxonomic units, VTUs），涵盖24个病毒科；其中107个VTUs仅由蛋白质同源性支持。研究鉴定出与巴纳病毒（Banna virus）相关的序列、一种与伊蚊（Aedes）相关的黄病毒，以及一种分歧型类荆门病毒（Jingmenvirus）候选体的4个推定组分。在调整采样点和测序深度后，宿主类群与病毒组科水平组成显著相关（R2 = 0.213, p = 0.0052），且该关联在多种特征定义下均保持稳定。三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）表现出最高的累积VTU丰富度，但其排名在文库数量均一化后发生变化。在该宿主中检出的大多数VTUs仅出现于单一采样点，且未检测到显著的单调距离衰减模式。本研究拓展了对云南蚊虫和蠓虫相关病毒多样性的认知，鉴定出可供进一步表征的代表性谱系，并记录了检出的病毒组中与宿主相关的差异。
论文解读
一、研究背景与科学问题
吸血节肢动物传播多种具有重要公共卫生和兽医意义的病毒。在双翅目（Diptera）内，蚊虫和蠓虫是此类病毒的重要媒介。它们的病毒组既包含虫媒病毒（arboviruses），也包含昆虫相关病毒。混合文库测序可回收源自血餐、寄生虫、微生物、植物或环境物质的病毒序列，因此宏基因组和宏转录组检测结果必须结合病原体监测背景及其宿主的更广泛病毒多样性进行解读。
与蚊虫和蠓虫相关的病毒群落因宿主分类群和地理位置而异。不同时空尺度的研究反复将宿主物种或其系统发育识别为病毒组组成的主要关联因素，而地理、季节、栖息地及局部环境条件也会影响特定病毒的出现和丰度。然而，在野外采集中分离这些关联十分困难，因为气候和栖息地影响宿主类群的出现，而采样力度和测序深度往往不均。此外，分析分辨率也增加了复杂性：科水平图谱可能掩盖相关病毒间的更替，而重叠群水平比较则可能因分别计数片段或基因组节段而夸大多样性。
中国云南省地处西南，与缅甸、老挝和越南接壤，地形涵盖低地、亚热带山地森林和高海拔高原生态系统，支撑了非凡的生物多样性，包括近300种记录的蚊科（Culicidae）物种。此前区域监测已检出日本脑炎病毒、登革病毒、巴纳病毒及多种蚊科相关病毒，但多数研究针对单一病原体、边境地区、养殖场或有限采样时段，全省范围内病毒多样性在宿主类群和采样点间的分布仍未得到充分表征。
二、研究内容与主要结论
本研究对2025年6月在云南15个采样点采集的、代表7个宿主类群的35个混合文库进行了总RNA测序和病毒组分析。研究保留1295条病毒重叠群，归入221个基于注释定义的病毒分类单元（VTUs），涵盖24个病毒科。研究评估了丰富度和组成在不同宿主类群、采样点、发育阶段和气候区间的差异，并检验了宿主类群关联在考虑采样设计后是否保持稳定。
研究得出以下主要结论：宿主类群与科水平病毒组组成显著相关，且该关联在调整采样点和测序深度后依然存在；三带喙库蚊表现出最高的累积VTU丰富度，但其排名在文库数量均一化后发生变化；该宿主中大多数VTUs仅见于单一采样点，且未检测到显著的单调距离衰减模式。研究还鉴定出巴纳病毒相关序列（覆盖全部12个基因组节段）、一种与伊蚊相关的黄病毒，以及一种由4个推定组分构成的分歧型类荆门病毒候选体WC-15。
三、关键技术与方法
研究人员采用的主要技术方法包括：在云南15个采样点采集7个宿主类群的蚊虫和蠓虫标本，构建35个混合测序文库；使用光催化诱蚊灯采集成蚊，幼虫以手网采集；采用总RNA提取后进行Illumina NovaSeq 6000平台双端150 bp测序；使用fastp进行质量过滤，以Bowtie2比对去除宿主和核糖体RNA序列，MEGAHIT进行从头组装；通过DIAMOND BLASTx（基于NCBI非冗余蛋白数据库nr）和BLASTn（基于NCBI核酸数据库nt）进行互补的蛋白质和核苷酸水平病毒鉴定；以RdRp保守结构域数据库辅助筛选；基于注释标签构建VTUs并进行丰度矩阵分析；使用MAFFT进行多序列比对、trimAl过滤、IQ-TREE v2构建最大似然系统发育树；通过PERMANOVA、PERMDISP、Mantel检验、Procrustes分析和稀有化（rarefaction）等方法进行生态统计。
四、研究结果
4.1 采样设计与病毒组总体组成
35个文库来自7个宿主类群在15个采样点的32个宿主类群-采样点组合，其中3个组合有重复文库。共获得1295条符合保留标准的病毒重叠群，归入221个VTUs，其中114个含至少一条核苷酸支持的contig，107个仅由蛋白质水平证据支持。85个VTUs（38.5%）仅含单条contig，中位长度834 nt。847条contig（65.4%）为核苷酸支持，448条（34.6%）为蛋白质支持。注释涵盖24个病毒科及一个科未解析类别。占比最大的科为正黏病毒科（Orthomyxoviridae，10.0%）、弹状病毒科（Rhabdoviridae，8.0%）、产黄病毒科（Chrysoviridae，4.3%）、周布尼亚病毒科（Peribunyaviridae，4.3%）和幻影病毒科（Phasmaviridae，4.2%）。
4.2 宿主相关的病毒丰富度和科组成
三带喙库蚊的累积观察丰富度最高，为103个VTUs，来自16个科、10个文库。每文库平均观察丰富度最高的是蠓科（Ceratopogonidae，18.7个VTUs，3个文库），其次为三带喙库蚊（16.8，10个文库）和白纹伊蚊（Aedes albopictus，16.6，5个文库）。观察丰富度与测序深度正相关（Spearman ρ = 0.392，p = 0.020）。稀有化至28,163,793条clean reads后每文库预期丰富度变化小于0.001个VTU。将文库数均一化为3个后，三带喙库蚊的累积计数中位数降至40.5个VTUs，而蠓科3个文库为54个。深度调整的负二项模型未检出总体宿主类群丰富度差异（似然比p = 0.412）。
4.3 病毒组发现与系统发育定位
研究选取正黏病毒科、周布尼亚病毒科、细小微病毒科（Phenuiviridae）、细小病毒科（Parvoviridae）和弹状病毒科5个科进行系统发育概览，5个比对分别包含23、122、142、12和539条序列，其中来自本研究35个文库的序列分别为9、2、1、2和9条。
4.3.1 代表性检出概览
代表性检出范围从已知病毒的近缘种到远缘蛋白质水平同源物不等。
4.3.2 巴纳病毒相关序列
WC-11文库的12条contigs被注释为巴纳病毒VP1–VP12，覆盖全部12个基因组节段。VP1为相对完整的3867 nt组装，具有最强的读段支持（1,394,956条重比对读段）。所有12个注释均与巴纳病毒参考序列有核苷酸水平匹配，同一性为97.28–99.65%。VP1在系统发育树上与菌株LF_M39（OR476072）直接聚为一支（SH-aLRT/UFBoot = 75.6/100，patristic距离0.00714），该菌株分离自云南禄丰的白纹伊蚊。
4.3.3 伊蚊相关黄病毒
WC-21序列（来自白纹伊蚊）在聚焦树中与伊蚊黄病毒菌株Narita-21（NC_012932）直接聚为一支（SH-aLRT/UFBoot = 97.6/100），该支还包含细胞融合因子病毒及其他昆虫特异病毒。其系统发育位置和核苷酸及氨基酸同一性支持将其归为已知昆虫特异黄病毒的近缘种。
4.3.4 分歧型类荆门病毒相关序列
WC-15蠓科文库（来自泸水）包含4条类荆门病毒相关编码序列，分别对应NS5/RdRp样、VP1样、NS3样和结构蛋白。NS5/RdRp和NS3蛋白与其最接近的蛋白质水平匹配（Lasius neglectus virus 4）分别共享34.9%（920个氨基酸，占预测997-aa ORF的92.3%）和29.4%（688个氨基酸，占预测872-aa ORF的78.9%）的同一性。4个组装分别为3276、2617、2875和3122 nt，总计11,890 nt，其功能注释与荆门病毒属成员的四组分组织一致。节段特异重比对在WC-15中产生34.1、30.9、36.6和80.9 RPM的丰度，近似1:1:1:2的分布模式。互补的编码功能、相关的组装5′基序和独立的读段重比对支持将这4条RNA视为候选WC-15类荆门病毒基因组的推定组分，但各组分间的物理连锁尚未得到证实。
4.4 跨宿主类群、生活史阶段和区域的生态结构
4.4.1 宿主类群与采样点水平关系
宿主类群项解释了35个科水平图谱间Bray-Curtis变异的36.7%（PERMANOVA，p < 0.001）。将置换限制在采样点内得到相同的效应量估计（p < 0.001）。调整采样点和测序深度后，边际宿主类群项解释了21.3%的变异（p = 0.0052）。同一宿主类群的文库对比不同宿主类群的文库对更不相似（中位Bray-Curtis相异度0.765对1.000），而同一采样点不同宿主类群仍高度不相似（中位0.997）。宿主类群关联在7项敏感性检验中均持续存在（解释26.3–29.0%变异，所有BH校正q = 0.0001）。PERMDISP提示组内离散度可能不等（F = 2.45，置换p = 0.0489），经小样本和Lingoes校正后p = 0.0850。15个采样点的宿主类群与病毒组构型间无显著Procrustes一致性（r = 0.369，p = 0.295）。
4.4.2 成虫-幼虫比较
4个成虫致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）文库和3个库蚊属幼虫文库共含46个VTUs。16个（34.8%）仅见于成虫池，8个（17.4%）共有，22个（47.8%）仅见于幼虫池。科水平排序未提供阶段相关差异的证据（PERMANOVA，R2 = 0.266，精确p = 0.143）。由于发育阶段、分类分辨率和采样点相互混杂，该比较描述的是所采样成虫池和幼虫池之间的差异，而非种内发育效应。
4.4.3 三带喙库蚊内的空间更替
三带喙库蚊提供了最大的宿主组内比较，包括来自9个采样点的10个文库。VTU丰富度从大理的8到楚雄的35不等。103个VTUs中77个（74.8%）仅在一个采样点检出，21个（20.4%）在2至4个采样点检出，5个（4.9%）在5个及以上采样点检出。文库间中位二元Jaccard相异度为0.872。单点检出在核苷酸过滤后（42/54，77.8%）和≥20读段过滤后（75.0%）仍然常见。未检测到地理距离与科水平相异度之间的显著单调关联（Spearman Mantel ρ = 0.089，p = 0.298）。
4.4.4 广气候区模式
15个采样点被分为两组：9个高原凉爽/温和站点（19个文库）和6个亚热带炎热/湿润站点（16个文库）。高原组每文库中位观察丰富度为14个VTUs（IQR，9.5–18.0），亚热带组为17.5（IQR，10.8–19.2；Wilcoxon p = 0.371）。累积VTU丰富度两组相似（144对146），而高原组包含更多contigs（729对566）和更多注释科（20对17）。没有单一气候区组在所有多样性指标上均排名更高。
五、讨论与结论
讨论部分指出，本研究拓展了云南蚊虫和蠓虫的病毒序列记录。昆虫相关病毒、部分组装和科未解析序列占主导的模式与大型宏转录组调查结果一致。巴纳病毒序列值得特别关注：WC-11包含全部12个基因组节段的序列，VP1与禄丰白纹伊蚊来源的菌株LF_M39密切相关，为该病毒的持续区域存在提供了明确定义的监测靶标。WC-15代表了另一种发现类型：其4个编码组分与已知荆门病毒仅有远缘关系，但基因内容与该类群的特征性非结构和结构蛋白互补相符，其系统发育高度分歧及在蠓科池中的检出拓宽了该类病毒被检出的节肢动物背景。三带喙库蚊的高累积丰富度需谨慎解读，因为该宿主类群拥有更多文库和更广的地理代表；该物种作为日本脑炎病毒的主要媒介，其监测价值应基于单个病毒谱系与已知脊椎动物宿主和媒介关联的评估，而非总丰富度。群落组成分析表明，同一宿主类群的文库比不同宿主类群的文库更相似，且该模式在考虑采样点和测序深度后仍存在，表明宿主组成是区域病毒组比较时必须考虑的因素。三带喙库蚊内的局部变异显著，但单点检出可能反映不完全检出、低丰度和不均的测序深度，Mantel检验未检出单调距离衰减模式并不排除空间结构的存在。
研究结论为：35个混合文库揭示了云南蚊虫和蠓虫中多样且局部异质的病毒组。巴纳病毒相关序列为区域监测提供了明确靶标，WC-15则增加了由4个推定组分代表的分歧型类荆门病毒候选体。经采样设计检验后，病毒组组成在不同宿主类群间存在差异，且采样最充分的宿主中大多数VTUs仅在一个采样点检出。这些是混合文库中的群落模式，而非感染或传播的证据。未来研究应优先开展宿主均衡的纵向采样以及对巴纳病毒和WC-15候选体的靶向分离。
