《Biology》：Effects of Different Formulations of Exogenous Nutrient Bag Waste on Soil Properties and Physiological Activities and Root Transcriptomic Responses of Oat
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本研究以青海省湟源县典型栗钙土为试验土壤，选用“白燕7号”、“青燕2号”和“青海444”三个燕麦品种进行混播，设置空白对照（CK）及五种不同配比的外源营养袋废弃物处理（PF-R-1至PF-R-5）。通过土壤理化性质分析、微生物量测定、RNA测序（RNA-Seq
本研究以青海省湟源县典型栗钙土为试验土壤，选用“白燕7号”、“青燕2号”和“青海444”三个燕麦品种进行混播，设置空白对照（CK）及五种不同配比的外源营养袋废弃物处理（PF-R-1至PF-R-5）。通过土壤理化性质分析、微生物量测定、RNA测序（RNA-Seq）及加权基因共表达网络分析（WGCNA），系统评估了不同配比外源营养袋废弃物对土壤养分有效性、微生物活性及燕麦根系基因表达的影响。结果表明，多数处理提高了土壤有机质、氮含量及微生物活性。转录组分析显示，PF-R-3与PF-R-2处理的比较组中差异表达基因（DEGs）总数最高，富集于核糖体蛋白翻译、氧化磷酸化能量代谢及DNA损伤修复等通路。此外，PF-R-3处理特有DEGs显著富集于氮代谢及次生代谢物生物合成通路；WGCNA鉴定出coral2模块为核心调控模块，其基因主要富集于跨膜转运及植物激素信号转导功能，与根系高效养分获取及代谢稳态维持高度一致。荧光染色证实羊肚菌菌丝成功定殖于燕麦根组织。综合土壤养分供应稳定性、根系基因表达调控及真菌定殖证据，PF-R-3处理（小麦+玉米芯+燕麦）在试验条件下为最具潜力的配比方案。然而，仍需结合产量与品质数据的田间试验方可给出最终推荐。本研究为高寒地区外源营养袋废弃物的资源化利用及燕麦绿色栽培提供了理论依据与技术支撑。
一、研究背景与意义
燕麦（Avena sativa L.）作为高寒农牧交错带重要的粮饲兼用作物，具有耐寒、耐贫瘠及适应性广等特点，在青海省及青藏高原农业生产中占据重要地位。然而，该区域受高海拔、低温及生长季短等自然条件制约，土壤有机质矿化速率缓慢、养分周转周期长。近年来，随着燕麦连作面积扩大及化肥依赖程度加深，土壤退化与肥力下降问题日益严峻，已成为制约燕麦产业绿色发展的关键瓶颈。
羊肚菌（Morchella spp.）人工栽培需向土壤添加外源营养袋以补充碳氮源并优化菌丝生长基质。栽培结束后，大量富含小麦、玉米芯、苜蓿及燕麦等未完全分解农林副产物的外源营养袋废弃物（ENB waste）常被直接丢弃或焚烧，既造成资源浪费又引发农业污染。已有研究表明，ENB废弃物富含粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、多糖、微量元素、维生素及矿物质等多种营养成分，且残留菌丝及其代谢产物可能携带特定生物活性物质，还田后可能影响后茬作物根系发育、养分吸收及抗逆性。然而，关于ENB废弃物直接作为土壤改良剂用于燕麦栽培的系统研究仍属空白，不同配比下的养分释放动态、对土壤微生态环境的调控效应及燕麦根系生长发育的分子调控机制尚不明确。
二、研究内容与主要结论
研究人员以青海省湟源县典型栗钙土为试验土壤，选用“白燕7号”、“青燕2号”和“青海444”三个当地燕麦品种按种子数1:1:1比例混播，设置空白对照（CK）及五种不同配比的ENB废弃物处理（PF-R-1至PF-R-5），采用随机完全区组设计（RCBD），每处理3次重复，共18个试验小区。通过动态监测土壤理化性质、酶活性及微生物量碳氮磷变化，结合RNA-Seq转录组测序与WGCNA共表达网络分析，并运用荧光染色技术验证羊肚菌菌丝定殖，系统评估了不同配比ENB废弃物还田的改土效应及燕麦根系的分子响应机制。
研究结果表明：ENB废弃物还田可有效提升土壤有机质、氮含量及微生物活性，改善土壤生物学性质，并对土壤pH具有一定调控作用。其中PF-R-3处理（小麦+玉米芯+燕麦）在整个生育期表现出均衡稳定的养分供应特征，土壤养分含量及生物活性始终维持中高水平，同时兼具盐碱改良效应。转录组分析显示，PF-R-2与PF-R-3比较组DEGs总数最高，富集于核糖体蛋白翻译、氧化磷酸化能量代谢及DNA损伤修复等通路，提示该处理可能增强根系基础代谢与能量利用效率。WGCNA鉴定出coral2核心模块，其基因富集于跨膜转运、转运蛋白活性及植物激素信号转导等功能，与根系养分获取及离子稳态维持高度一致。荧光显微镜观察证实羊肚菌菌丝可成功穿透燕麦表皮并定殖于根组织内部，表明菌丝与燕麦根系存在密切的菌根关联。
三、关键技术与方法
本研究主要采用以下核心技术方法：基于Illumina NovaSeq X Plus平台的高通量RNA-Seq转录组测序（委托广州基迪奥生物科技有限公司完成，样本于2025年7月28日采集，每处理3次重复，每小区6个取样点、每点3株根系混合后提取RNA）；DESeq2差异表达分析（阈值：FDR < 0.05，|log?FC| > 1）；GO与KEGG富集分析；WGCNA加权基因共表达网络分析（软阈值β ≥ 9，模块-性状相关性筛选标准为|r| ≥ 0.35且p < 0.01）；WGA-PI荧光染色技术（委托武汉赛维尔生物科技有限公司完成）验证羊肚菌菌丝定殖。
四、研究结果
4.1 外源营养袋废弃物对土壤性质及生理活性的影响
在播种前、生育中期（81天）及收获期（159天）三个时间点对土壤理化性质与生物学性质进行动态监测。结果显示，多数处理提高了土壤有机质、全氮、碱解氮及微生物量碳氮磷含量。PF-R-1处理在前期表现出最高的土壤有机质、全氮、碱解氮含量及脲酶、蛋白酶活性和微生物量碳氮磷水平，而PF-R-5处理的基础养分含量和生物活性显著较低。PF-R-2处理初始电导率（EC）值较高，存在短期盐胁迫风险；CK处理pH显著高于所有ENB处理。生育中期，PF-R-4处理土壤养分及微生物活性升至峰值，表现出较强的中期供肥能力；PF-R-3处理维持中高水平养分供应及稳定的微生物活性。收获期，PF-R-5处理后期释放大量碳氮养分，土壤酶活性显著升高；PF-R-1处理养分前期消耗殆尽，微生物活性明显下降；PF-R-3处理仍维持中高水平土壤养分含量及生物活性，养分供应模式均衡稳定。
4.2 不同处理对燕麦根系基因表达的影响
RNA-Seq分析共获得各处理组共享核心序列36,872条。PF-R-4处理独有序列数最高（2756条），其次为PF-R-5（2162条）和PF-R-2（2074条），而CK（653条）、PF-R-1（335条）和PF-R-3（344条）较少。主成分分析（PCA）显示PC1和PC2分别解释59.8%和22.6%的方差，累计贡献率达82.4%。差异表达分析表明，PF-R-2与PF-R-3比较组差异序列总数最高，下调序列数略多于上调序列数，转录差异最为显著；PF-R-4与PF-R-5比较组上调序列数远多于下调序列数，表明PF-R-4相对PF-R-5主要驱动基因激活。
4.3 不同处理下DEGs的GO与KEGG富集分析
GO富集分析显示，CK与PF-R-1比较组上下调基因在核心GO条目中分布均衡；PF-R-2与PF-R-3比较组注释到GO条目的DEGs总数最高，细胞代谢、催化活性及细胞结构相关通路以下调DEGs为主；PF-R-4与PF-R-5比较组所有核心GO类别以上调基因为主。KEGG通路富集分析表明，PF-R-2与PF-R-3比较组的通路富集显著性、基因富集比及通路覆盖率均为三组比较中最高，核糖体蛋白翻译、氧化磷酸化能量代谢及DNA损伤修复通路被强烈差异富集；PF-R-4与PF-R-5比较组特异性富集于植物激素信号转导、类胡萝卜素生物合成及二萜生物合成通路。
4.4 差异表达基因共表达网络分析
WGCNA分析确定软阈值β ≥ 9时网络满足无尺度拓扑准则。基因聚类树显示多数基因分支在高度0.4至0.8范围内合并，表明基因间存在稳定显著的共表达关联。经动态树切及模块合并后获得多个共表达模块，其中blue、black和turquoise模块为基因数最多的主导模块。模块间相关性分析显示，MM.blue模块与MM.cyan、MM.indianred4及MM.firebrick4等模块呈显著负相关，而红色系模块间高度正相关。coral2模块与菌丝生长率呈显著正相关（r = 0.849，p = 8.45 × 10??），被选为核心调控模块。
4.5 根系模块基因的GO与KEGG富集分析
coral2模块GO富集分析显示，显著富集的基因功能主要集中于氨基酸代谢与渗透调节、细胞壁重塑及膜脂结合三类。关键酶基因如二氨基丁酸转氨酶、鸟氨酸转氨酶及4-氨基丁酸转氨酶的富集表明，燕麦通过激活脯氨酸和GABA合成通路增强渗透调节及活性氧清除能力。KEGG富集分析显示剪接体、mRNA监视通路及核质转运通路显著富集，提示可变剪接事件在燕麦快速适应复杂土壤环境中发挥关键分子开关作用。经CytoHubba 12种算法筛选获得15个核心基因（hub genes），功能注释显示其功能涵盖信号转导（MAPKKK17、CAM1）、细胞壁合成（CESA3-1、CESA3-2）、囊泡运输与细胞分裂（DRP1A、DRP1C）、甲基化调控（SAHH）及转录调控（AZF1）等多个层面。
4.6 燕麦根系真菌结构的WGA-PI染色
荧光显微镜观察直接证实真菌菌丝能够成功定殖并侵入燕麦根组织。PF-R-1处理根系未观察到真菌定殖，维管束及皮层结构完整，未检测到外源真菌特异性绿色荧光信号。PF-R-2至PF-R-5处理组根系切片中检测到真菌菌丝特征性绿色荧光信号，菌丝分布于根皮层细胞间隙及组织内部。其中PF-R-4处理可观察到完整的菌丝环嵌入燕麦根组织，PF-R-2、PF-R-3及PF-R-5处理中亦分布有碎片化或点状真菌荧光信号，表明真菌菌丝能够穿透燕麦表皮并定殖于根内部。
五、讨论与结论
讨论部分指出，ENB废弃物还田显著提高土壤有机质、氮含量及微生物活性，与既往关于菌渣还田改良土壤的研究结果一致。PF-R-3处理（小麦+玉米芯+燕麦）表现出最平缓均衡的养分供应曲线，可能归因于不同有机物料组合的碳氮比及木质纤维素组成差异。转录组分析中氧化磷酸化通路基因富集提示根系线粒体能量代谢可能增强，但研究未直接测定线粒体呼吸、ATP含量或转运蛋白活性，该解释仍属初步推断。与CK相比，PF-R-3处理显著上调根系NRT和AMT家族基因表达，与PF-R-3处理下显著更高的土壤碱解氮含量一致。coral2核心模块的功能特征与水稻和杨树中已报道的养分响应核心模块功能相似，提示植物对不同类型有机物料还田的分子响应可能涉及保守的调控网络。羊肚菌作为腐生真菌并非典型植物病原菌，其在根组织内的存在可能被植物感知为非威胁性微生物关联，但此类识别是否导致防御启动或生长调节仍需实验验证。
研究结论：ENB废弃物还田可增加土壤有机质、氮含量及微生物活性，并改善土壤盐碱状况。其中PF-R-3处理（小麦+玉米芯+燕麦）在生育期内表现出相对稳定的养分供应特征，多数土壤参数维持中高水平。转录组比较显示PF-R-3与PF-R-2比较组DEGs数量最高，富集于核糖体翻译、氧化磷酸化及DNA修复通路，提示该基质组合可能在基因表达水平与基础代谢及能量利用增强存在潜在关联。coral2 WGCNA模块富集于跨膜转运及植物激素信号转导基因，可能有助于根系养分吸收及逆境适应。荧光显微镜证实羊肚菌菌丝与燕麦根系存在关联，提示真菌-根系互作可能参与上述调控过程。然而，由于籽粒产量与品质数据尚不可得，且根系相关羊肚菌的功能角色有待表征，PF-R-3应被视为有前景的候选方案而非最终推荐。在提出实际应用建议前，仍需开展整合农艺表现及长期土壤健康评估的田间试验。
