抑制mTORC1信号与短暂树突修剪支持成年斑马鱼轴突再生

《iScience》：Repressed mTORC1 signaling and transient dendritic pruning support axonal regeneration in adult zebrafish

　　

树突变性（dendrite degeneration）是轴突损伤后的早期病理特征，但其在成功轴突再生中的作用仍知之甚少。研究人员利用成年斑马鱼视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells, RGCs）的稀疏标记（sparse labeling），证明轴突再生伴随视神经挤压（optic nerve crush, ONC）后短暂的树突修剪（dendritic pruning）阶段。树突修剪发生在轴突延伸期间，并在脑重新支配（brain reinnervation）后逆转。尽管胰岛素-雷帕霉素机制靶点（insulin-mechanistic target of rapamycin, mTOR）信号在损伤后立即快速上调，但随后被抑制，与树突修剪和持续轴突生长相吻合。通过胰岛素处理或直接通路刺激延长mTOR激活，以mTORC1依赖方式减少树突修剪，但显著延迟轴突再生长。总之，这些发现将树突重塑（dendritic remodeling）确定为斑马鱼轴突再生中受时间调控的组成部分，并揭示树突保存与轴突再生长之间的功能权衡。这值得进一步研究树突重塑的时间调节是否能促进哺乳动物中枢神经系统（central nervous system, CNS）的轴突再生。

成年哺乳动物中枢神经系统（central nervous system, CNS）修复能力有限，轴突损伤可导致功能丧失并最终引起神经元死亡。树突退化（dendrite degeneration）是CNS神经元轴突损伤后的早期反应，被认为会进一步促进神经元功能衰退。在小鼠视网膜系统中，视神经挤压（optic nerve crush, ONC）研究显示，雷帕霉素机制靶点（mechanistic target of rapamycin, mTOR）信号下调是轴突损伤后树突丢失的主要驱动因素；防止ONC后mTOR抑制可保存树突结构并改善损伤结局，而胰岛素刺激mTOR甚至可促进树突再生长。与哺乳动物不同，成年斑马鱼具有显著再生能力。ONC后，成年斑马鱼视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells, RGCs）不发生丢失，并约在2周内恢复大多数视觉引导行为。尽管具有这种再生韧性，损伤斑马鱼内丛状层（inner plexiform layer, IPL）仍发生早期但可逆的变薄，反映短暂树突修剪（dendritic pruning）；IPL厚度仅在成功重新支配脑靶标后恢复。打乱该修剪反应会延迟再生，提示树突可塑性对成功轴突再生长具有许可和潜在整合作用。基于此，研究人员利用自发再生的成年斑马鱼，解析轴突再生期间树突重塑的形态特征及其分子机制。

研究人员使用Tg(gfi1ab:gal4;UAS:lynGFP)转基因成年斑马鱼稀疏标记RGCs，结合单细胞树突重建、ONC模型、转录组分析、免疫组化和药理学干预，发现轴突再生伴随短暂树突修剪，该过程与胰岛素-mTOR信号暂时抑制相关；延长mTOR激活可减少树突修剪，但延迟轴突再生长和视盖重新支配。该研究将树突重塑确定为轴突再生中受时间调控的组成部分，并揭示树突保存与轴突再生长之间的功能权衡，提示树突重塑的时间调节可能对促进哺乳动物CNS轴突再生具有转化意义。关键技术方法包括：使用Tg(gfi1ab:gal4;UAS:lynGFP)系稀疏标记RGCs；建立单侧ONC模型并在2、3、6、10、14、21 dpi取样；对视网膜铺片行GFP和胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase, ChAT）免疫染色，追踪单细胞树突并以ChAT带标准化IPL深度；玻璃体腔注射人重组胰岛素、rapamycin和MHY1485；顺行biocytin追踪量化视盖重新支配；对视网膜切片行pS6^Ser235/236、pS6^Ser240/244和pGsk3β^Ser9免疫组化；重分析已发表FACS分选成年斑马鱼RGCs ONC后bulk RNA测序数据集（GEO: GSE289140，Zhang et al.数据集）。

研究结果如下。

Characterization of gfi1ab-expressing RGCs in the adult zebrafish retina：研究人员通过该转基因系观察到，稀疏标记RGCs主要位于成年斑马鱼视网膜中央至中周边背侧区域，并投射至背内侧视盖的SFGS、SGC和SAC/SPV。基于树突形态和IPL分层，鉴定出3种主要RGC形态类型：两种类似已知幼虫类型D4和B2，另一种为新的D5。D4和D5具有较大、较复杂的树突树，B2较小；D4约占40%，B2约占30%，D5约占15%。结论是该转基因系适合在单RGC水平分析树突复杂性和分层。

A reduction of dendritic complexity after ONC precedes brain reinnervation：通过比较未损伤视网膜与ONC后2、3、6、10、14、21 dpi的树突结构，研究人员发现2 dpi树突复杂性无变化；3 dpi总分叉数、总树突长度和Sholl曲线下面积（area under the curve, AUC）约减少30%；6 dpi分叉数降至未损伤水平约60%。树突野总面积未显著改变，提示主要消除终末分支。10 dpi总树突长度和Sholl曲线恢复；21 dpi分叉数显著恢复但未达未损伤水平。结论是短暂树突简化伴随轴突再生长，并在脑重新支配后、视觉功能恢复前基本重建。

A transient downregulation in expression of the insulin cascade underlies dendritic remodeling and axonal regeneration：研究人员重分析GEO: GSE289140数据集，基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示突触和树突相关术语在1–6 dpi下调，3 dpi最显著。胰岛素-PI3K-Akt-mTOR级联在转录水平协调下调，1 dpi出现，3 dpi最大，6 dpi持续；irs1/irs2a、pik3r1/2/3、akt3a、rptor、rictora/b、rheb、tsc1a/tsc2等降低，ptpn1和socs3a/b升高，gsk3bb强诱导；10 dpi基本正常化。结论是最大轴突延伸期存在短暂营养信号降低。

Injury-induced dendritic pruning is associated with repressed mTOR signaling rather than Gsk3β activity：通过pS6^Ser235/236和pS6^Ser240/244免疫组化评估mTOR通路活性，研究人员发现ONC后1–2 dpi神经节细胞层（ganglion cell layer, GCL）中pS6阳性细胞增加，3–10 dpi降至约5%。总Gsk3β在6 dpi增加，但抑制性pGsk3β^Ser9从3 dpi升高并持续至10 dpi，pGsk3β/total比例在6 dpi较高。结论是3–6 dpi树突修剪主要与mTORC1信号抑制相关，而非Gsk3β活性增强。

Prolonged insulin signaling activation results in reduced dendritic remodeling and delayed brain reinnervation：研究人员在2–4 dpi玻璃体腔注射人重组胰岛素，3 dpi时pS6阳性GCL细胞增加，Ser^235/236约3倍、Ser^240/244约5倍。6 dpi胰岛素处理组树突Sholl AUC、树突面积、总树突长度和分支点高于vehicle。顺行biocytin追踪显示6 dpi视盖重新支配减少约50%。结论是持续胰岛素信号部分保存树突复杂性，但显著延迟脑重新支配。

Downregulation of mTORC1 signaling supports sustained axonal regrowth：通过联合给予胰岛素和rapamycin，研究人员发现rapamycin降低GCL中pS6，并逆转胰岛素依赖的树突维持；MHY1485仅增加Ser^240/244位点pS6，并增加树突复杂性。轴突追踪显示MHY1485和胰岛素加rapamycin均使6 dpi视盖重新支配减少约50%。结论是胰岛素对树突的保存效应依赖mTORC1；直接药理学抑制树突修剪不利于轴突再生，短暂树突修剪与mTORC1抑制支持持续轴突再生长。

讨论部分总结认为，树突修剪既是轴突损伤早期表型，也出现在再生能力系统中；维持树突可限制轴突再生长。mTOR在损伤后可能呈双相作用：早期激活启动再生程序，随后抑制驱动树突修剪并允许及时轴突延伸。讨论提出神经元内资源分配和区室化信号模型，认为维持突触后结构和树突树可能限制可用于轴突再生的资源池。研究局限包括仅评估有限RGC形态类型、主要采用药理学操作、未剖析其他视网膜细胞类型贡献以及未表征RGC电活动等。研究结论部分翻译：总之，这些发现将树突重塑确定为斑马鱼轴突再生中受时间调控的组成部分，并揭示树突保存与轴突再生长之间的功能权衡。这值得进一步研究树突重塑的时间调节是否能促进哺乳动物中枢神经系统（CNS）的轴突再生。