《Current Issues in Molecular Biology》：Understanding Aging Genes and Pathways: Insight from Yeast
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尽管学界普遍认同人类长寿具有遗传性，但影响寿命的遗传与非遗传因素所构成的复杂网络远未被完全阐明。在此背景下，简单模式生物仍有助于理解长寿所涉及的基本机制，并可能揭示新的治疗靶点。以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为研究对象——这一最
尽管学界普遍认同人类长寿具有遗传性，但影响寿命的遗传与非遗传因素所构成的复杂网络远未被完全阐明。在此背景下，简单模式生物仍有助于理解长寿所涉及的基本机制，并可能揭示新的治疗靶点。以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为研究对象——这一最简单的真核模式系统——已鉴定出Ras-cAMP-PKA、TOR和Sch9通路为促衰老信号级联。尽管这一单细胞真菌与复杂哺乳动物在进化上相距甚远，但酵母中的部分观察结果最终已在包括人类在内的高等生物中得到证实。该模式生物的高度可操作性还使其能够对这些通路进行详细的分子表征，从而鉴定潜在的治疗靶点。此外，这些营养依赖通路的分子表征有助于筛选能够调节应激抵抗、细胞营养应答和自噬的分子。这种从裂殖酵母延伸至哺乳动物的进化保守性，使酵母成为筛选影响长寿的分子、药物和饮食干预措施的重要工具。本文阐述了研究酵母衰老的主要方法、获得的主要发现及其在高等生物中的转化有效性。
论文主体内容总结
1. 引言
酵母自远古埃及起便用于面包、葡萄酒和啤酒制作，中国考古证据更将其使用历史追溯至公元前7000年。现代酵母已成为细胞生物学、遗传学和分子生物学的基石，同时仍是食品、饮料及药品工业生产的核心。其优势在于成本低廉、生物信息资源丰富、生化与遗传方法体系完善，以及与高通量技术的高度兼容性。子囊菌出芽酵母和裂殖酵母因此成为重要的模式生物。衰老研究领域亦充分利用了这些实验系统，尽管其在阐明人类长寿机制方面存在明显局限：单细胞生物的生命周期曲线无法提供健康寿命或特定器官组织年龄依赖性改变的信息；广泛的遗传操作虽对鉴定衰老相关基因和通路至关重要，但部分结果基于单一遗传背景，难以得出普遍结论；实验室条件通常固定不变，无法反映野生栖息地的波动环境；短世代和短寿命虽允许快速数据收集，但短命生物可能表现出远大于人类的寿命延长能力。然而，大量证据证实了酵母作为模式系统的价值，近几十年来五项诺贝尔奖授予了基于酵母的研究即为明证。全基因组测序的完成确认了酵母与进化上遥远物种间的高度同源性，生物信息学分析显示酿酒酵母拥有约30%人类致病基因的直系同源基因，提示可利用人源化酵母作为多种人类病理的模型。
2. 实验室衰老研究方法
2.1. 寿命测定
酿酒酵母衰老的首次证明利用了该生物独特的细胞分裂方式——出芽过程中子细胞从母细胞萌出，便于基于大小区分母细胞与子细胞，从而计数单个细胞的分裂次数。Mortimer首创利用这一不对称出芽特性通过显微操作在每个细胞周期移除新生芽体来测定酵母细胞的复制潜能，该方案用于测定复制寿命（RLS），至今仍在使用。常用实验室酵母菌株在进入衰老前约经历20次细胞分裂，每个细胞周期约2小时，单次实验可能需要长达40小时的连续监测。方法学改进包括利用麦胚凝集素标记含几丁质的芽痕以富集芽痕丰富细胞、母细胞富集程序（MEP）——一种基于Cre重组酶的可诱导遗传系统抑制子细胞增殖，以及多种依赖水动力捕获保留较大母细胞而冲走较小子细胞的微流控平台。值得注意的是，RLS测定所用培养基通常富含葡萄糖，细胞代谢主要依赖糖酵解，这与高等生物多数组织以呼吸为主的能量代谢不同；但近期研究提示复制衰老过程中也存在从发酵向呼吸型代谢的转变。由Longo等人开发的时序寿命（CLS）测定法测量非分裂酵母细胞的存活时长，标准方案将细胞接种于合成液体培养基，定期取样稀释涂板计数菌落形成单位（CFUs），以第三天CFUs为100%参考值。多种变体方案被引入以提高自动化与可重复性，包括96孔板光密度测定法、固体平板CLS测定法、碘化丙啶结合流式细胞术，以及微阵列结合分子条形码测序的高通量筛选。裂殖酵母因对称分裂难以区分母细胞与子细胞，RLS研究受限，但CLS已常规测定。两种范式在代谢上差异显著：RLS细胞几乎完全依赖糖酵解，而CLS细胞利用发酵和呼吸作为主要能量来源，更接近高等真核生物多数组织的代谢特征。经典CLS实验的常见伪影是衰老细胞再生长，可通过重复水洗培养物或使用固体Trp平板法消除。
2.2. 应激抵抗与基因组稳定性测定
细胞存活与多重应激抵抗之间的密切联系使后者被用作鉴定衰老相关基因和机制的可选择标记。热激抵抗通过将细胞系列稀释液涂布于富培养基后在55°C孵育30分钟至2小时测定。氧化应激抵抗测定将细胞重悬于磷酸钾缓冲液并添加不同浓度过氧化氢处理30分钟，或使用甲萘醌诱导胞内活性氧产生。渗透应激触发高渗甘油（HOG）MAP激酶信号通路，可通过添加山梨醇或甘露醇诱导非离子渗透应激，或添加NaCl或KCl诱导离子/盐渗透应激。营养物质的质与量可调节应激源的效力，提示营养可用性可能调控细胞抵抗力和长寿。基因组不稳定被认为是衰老的驱动因素之一，体细胞突变率与物种寿命呈反比。酵母模型可低成本检测多种突变类型：5-氟乳清酸（5-FOA）抗性测定URA3基因功能丧失突变；刀豆氨酸抗性测定CAN1精氨酸通透酶失活突变，主要检测点突变；α因子阻断MATa细胞分裂，任何影响该信号级联的突变均可恢复分裂。无义密码子回复突变可利用携带trp1-289等位基因的菌株检测，移码突变需使用LYS2基因座经工程化插入造成移码的测试菌株，而大范围染色体重排（GCRs）则需替换HXT13基因为URA3标记并结合CAN1双重选择系统。
3. 衰老基因与通路
3.1. RAS-PKA通路
该通路在衰老研究中的关注始于逆转录病毒v-Ha-RAS在酵母中的表达导致RLS延长。后续RLS研究显示RAS2缺失缩短RLS而RAS1缺失产生相反效应，但RAS2缺失使酵母CLS加倍并显著增强多重应激抵抗。Ras蛋白属于单体G蛋白超家族，在GDP结合的非活性态与GTP结合的活性态之间循环，调节酵母细胞代谢与增殖。在酿酒酵母中，Ras活性增强刺激腺苷酸环化酶产生cAMP，进而激活蛋白激酶A（PKA）。PKA通路在衰老中的作用首先在酵母中鉴定，裂殖酵母中git3、git5和pka1缺失菌株亦表现CLS延长。PKA的促衰老效应主要通过抑制Msn2p和Msn4p这两个关键应激响应转录因子介导，机制上PKA激活导致Rim15p激酶抑制，从而阻止Gis1p、Msn2p和Msn4p转录因子激活，这些因子在低PKA活性条件下结合后助长转变（PDS）元件和应激响应元件（STREs），驱动胞质过氧化氢酶、超氧化物歧化酶（SOD1和SOD2）、热激蛋白（HSPs）及多重应激响应基因DDR2等细胞保护基因的表达。裂殖酵母中PKA通路抑制激活Sty1通路，Sty1过表达延长该生物CLS。高等真核生物中的研究证实了酵母观察结果：小鼠催化性PKA亚基缺失带来健康益处，腺苷酸环化酶5缺失改善心脏衰老并延长小鼠寿命。
3.2. TOR-SCH9通路
雷帕霉素最初从土壤细菌吸水链霉菌中纯化并以其抗真菌活性著称，后经酵母遗传学鉴定其作用机制：与Fkbp12p伴侣蛋白形成复合物抑制名为雷帕霉素靶蛋白（TOR）的蛋白激酶。大规模单基因缺失菌株库结合RLS测定的系统筛选将TOR轴鉴定为强效促衰老通路，该发现后被CLS测定证实。这些RLS实验还验证了Sch9p的促衰老功能。TOR蛋白作为两个不同复合物的催化亚基：TORC1和TORC2，仅TORC1对雷帕霉素敏感。酵母中TOR1和TOR2两个基因编码TORC1催化亚基，TORC2仅含Tor2p。TORC1由Tor1p或Tor2p与三个调节亚基Lst8p、Tco89p和Kog1p组成。TORC1通过Rag GTP酶依赖和非依赖两种机制被激活，两者均由氨基酸可用性激活。代谢层面，TORC1被营养物特别是氨基酸激活时促进合成代谢和细胞生长，抑制分解代谢和应激响应，调节蛋白质合成、鞘脂代谢、细胞周期进程、应激响应和自噬。TORC1的主要效应因子之一是AGC家族蛋白激酶Sch9p，其将营养可用性与细胞周期进程、细胞大小和自噬联系起来。SCH9基因最初被鉴定为温度敏感cdc25等位基因生长缺陷的多拷贝抑制子，Sch9p与哺乳动物AKT1和S6K1蛋白激酶具有结构和功能相似性，与TORC1共定位于液泡膜。Sch9p通过多种蛋白激酶对多个氨基酸残基的磷酸化被激活，包括Pkh1p、Pkh2p和Pkh3p（哺乳动物PDK1的直系同源物，被鞘脂激活）、TORC1磷酸化疏水基序多个残基，以及周期蛋白依赖性激酶Bur1p和Pho85p。裂殖酵母拥有两个SCH9直系同源基因sck1和sck2，sck2缺失仅在野生型Sty1 MAP激酶存在时延长时序寿命。Sch9p直接或间接调节众多下游效应因子，其中Rim15p在应激响应和衰老中发挥核心作用：Sch9p激酶抑制导致Rim15p转位至细胞核，激活Msn2/4p和Hsf1p等转录因子，激活含STRE、HSE或PDS元件的基因表达。SCH9缺失显著降低时序衰老过程中的整体突变频率和DNA损伤，sch9Δ细胞表现出增强的SOD2表达和更高的氧化应激抵抗。tor1Δ或sch9Δ细胞表现出升高的呼吸能力，短暂增加ROS水平，通过类似线粒体线粒体激效效应的机制促进长寿。TOR作为促衰老通路的核心作用已在高等真核生物中广泛证实：秀丽隐杆线虫中let-363（mTOR直系同源物）的无效突变或RNAi敲低显著延长寿命；果蝇中dTsc1或dTsc2过表达及dTOR或ds6k显性负性形式表达促进长寿；小鼠中mTOR信号抑制延长中位和最大寿命，雷帕霉素给药保留卵巢储备并延长生殖寿命，S6激酶抑制延长小鼠健康寿命和寿命。
4. 营养与长寿
Ras-PKA和TOR-Sch9通路的抑制（单独或联合）促进长寿，主要通过激活Hsf1p、Msn2p和Msn4p转录因子增强应激抵抗实现。营养可用性是简单真核生物寿命的主要外源调节因子，热量限制是延长高等真核生物寿命的有效方法。在酿酒酵母中，可发酵碳源的存在触发Ras-腺苷酸环化酶（AC）-PKA通路，含氮化合物调节Pkh/Pdk和Tor-Sch9/S6k信号分支。这些营养感知节点的药理学或遗传学下调与寿命和应激抵抗的延长密切相关。热量限制通常通过降低葡萄糖可用性实现，氮限制通过上调自噬、RNA加工和线粒体生物能量学促进长寿。已知热量限制抑制TORC1，进而增加自噬，酵母中已鉴定超过40个自噬相关基因，多数在高等真核生物中保守。糖可用性研究显示葡萄糖和果糖过量导致CLS缩短，TOR1或VAC8缺失改善存活并改变胞内神经酰胺浓度，而药物处理导致神经酰胺积累则缩短寿命。氨基酸可用性降低可延长CLS，TORC1抑制降低蛋白质合成速率从而延长寿命，核糖体生物发生受损突变和RNA聚合酶III合成减少亦产生相同结果。精氨酸和亮氨酸作为TOR激活因子，而缬氨酸、丝氨酸和苏氨酸通过调节Pkhs和TOR调节Sch9p磷酸化状态。
5. 人类长寿的决定因素
建立特定人类等位变异与长寿表型之间的明确关联极具挑战性，目前仅限于少数位点。去除意外等外源因素混杂后，长寿遗传力估计可增加至50%。多项研究确认饮食在动物模型和人类中的核心作用：热量限制可延长哺乳动物模型寿命，抑制合成代谢激素和炎症细胞因子，减少细胞增殖和氧化应激，促进DNA修复机制和自噬。酵母研究显示SCH9缺失延缓年龄依赖性突变率增加，提示TORC1复合物在此过程中的作用。长期雷帕霉素治疗降低衰老小鼠线粒体突变频率，减少癌症发生和进展，增加自噬，并显著减少产生促炎细胞因子IL17的γδ T细胞。然而慢性雷帕霉素治疗引发葡萄糖不耐受和血脂异常，其免疫抑制作用可能增加感染风险，限制其作为抗衰老药物的应用。德国长寿队列病例对照研究显示长寿组中鉴定的多个罕见突变聚集于mTOR信号通路。Ras和PKA通路的作用亦在哺乳动物中得到确认：胰岛素/IGF-1信号级联是调节哺乳动物长寿的最知名通路，IGF1-R激活抑制FOXO3转录因子，FOXO3基因型与人类长寿密切相关。FOXO3表达增加通过激活SOD2和CAT等抗氧化基因转录增强应激抵抗。PKA在哺乳动物组织中普遍表达，小鼠RIIβ调节亚基功能丧失导致胰岛素敏感性增加、瘦表型和寿命延长，缺乏Cβ催化亚基异构体的小鼠免受体重增加、肝脏增大和心脏功能障碍的影响。人类研究还发现TOMM40/APOE/APOC1基因簇和FOXO3基因与长寿显著相关，载脂蛋白E的ε2等位基因通过降低心血管和阿尔茨海默病风险促进长寿，而ε4变异产生相反效应。长寿相关基因中约半数参与氧化应激响应、脂质代谢和DNA损伤响应。百岁老人研究鉴定出增强的DNA修复活性、较低的基因组损伤频率和较长的端粒。营养和营养依赖通路可能促进低度系统性慢性炎症，即炎性衰老过程，在短寿个体中更为显著。从酵母到哺乳动物进化保守的基本细胞机制包括应激抵抗、基因组稳定性、饮食及其组成、热量限制、营养信号通路和线粒体功能障碍，而低度炎症、免疫衰老、炎性衰老、干细胞耗竭和脂质代谢特定组分则需要更接近的哺乳动物模型系统。
6. 结论
衰老过程是高度复杂和多因素的现象。近期文献提示寿命延长的重要决定因素可能不在于基因组序列本身，而在于基因组和基因产物的动态调节，这种调节由多种外源因素特别是营养物和信号分子的复杂相互作用驱动。从静态遗传决定论向适应性信号传导的范式转变对开发延长生存和增强健康寿命的干预措施具有战略优势，因为基因组基本不可改变，而代谢通路高度可塑。酵母作为最简单的真核模式系统，具有伦理约束少、成本效益高和丰富的生物信息学、遗传学和分子工具等优势，短寿命允许在实用时间框架内纵向监测多代。酵母还提供数十亿同基因个体的独特可用性，便于精确区分环境与遗传决定因素。继Ras作为基本促衰老通路的里程碑发现后，酵母已成为鉴定关键长寿相关基因和信号级联的主要模型，最显著的是Sch9-TOR轴——第二个进化保守的促衰老通路。这些通路对营养感知的调节依赖性导致了对葡萄糖和特定氨基酸等个别营养物特定角色的表征，酵母中最初发现的营养影响随后在哺乳动物模型中得到验证。仍待解答的问题包括：氧化应激造成的损伤是否至少部分可逆？是否存在能够在促衰老信号存在下激活应激抵抗的替代细胞通路？哪些环境条件或物质可以激活它们？回答这些问题可能提出不仅延缓衰老而且促进年轻化的干预措施。
