染色质阅读器抑制剂细胞内靶点结合分析的模块化平台

《Cell Chemical Biology》：A modular platform for in cellulo target engagement profiling of chromatin reader inhibitors

意义

针对表观遗传机制的药物发现受到严重瓶颈的制约，即缺乏可扩展的、基于细胞内的方法来准确分析脱靶结合并验证分子特异性。传统上，评估小分子抑制剂需要繁琐的体外蛋白纯化和生物物理表征，这些工作流程剥离了靶标的天然细胞环境，包括必需的翻译后修饰、定位以及蛋白-蛋白相互作用。替代性的细胞内技术，如NanoBRET或基于FRAP的活细胞成像，往往受限于复杂化学探针设计的必要性，或靶表观遗传读取蛋白固有的、高度瞬时的结合动力学。本研究通过建立Acyl-eCR平台弥合了这一重大技术鸿沟，这是一个可扩展的细胞系统，利用与eGFP融合的结合结构域模块来模拟全长内源蛋白的行为。通过引入两种互补的流式细胞术检测，即PROTAC驱动的竞争性结合检测和降解非依赖性核保留检测，本研究为化学生物学家提供了一种工具，可以快速量化细胞靶点结合并绘制结合域家族树上抑制剂的.selectivity地图。至关重要的是，该平台绕过了重组蛋白工作流程的要求，并兼容高度移动或研究不足的读取蛋白，这些蛋白传统上难以表征。由于该架构本身具有模块化特性，它可作为一个通用框架，用于跨染色质读取家族的细胞靶点结合分析。

亮点

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Acyl-eCR在活细胞中量化结合域靶点结合

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竞争性PROTAC检测在细胞内测量抑制剂效力

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核保留提供降解非依赖性的靶点结合检测

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模块化Acyl-eCR实现染色质读取抑制剂的可扩展分析

摘要

酰化读取结合域蛋白的失调与多种疾病相关，使其成为重要的治疗靶点。然而，药物开发受到缺乏高通量细胞检测以测量活细胞中靶点结合和脱靶结合的阻碍。为弥补这一空白，我们开发了一组表达合成结合域构建体的细胞系，称为Acyl-eCR。我们证明，Acyl-eCR再现了与内源蛋白对结合域抑制剂和PROTAC相同的反应，允许对药物效应进行定量评估。我们引入了两种互补的流式细胞术检测来评估抑制剂-靶点结合：利用PROTAC诱导降解的竞争性结合检测和测量结合域从染色质位移的核保留检测。我们的方法绕过了繁琐的蛋白纯化和体外表征，提供了一种可扩展的、生理相关的方法，用于评估抑制剂效力和特异性。该平台提供了一种可扩展的策略，用于在活细胞中定量分析染色质读取抑制剂的靶点结合。

图解摘要