人iPSC来源MSCs通过激活PVN OT+神经元改善小鼠孤独症样表型

《SCIENCE ADVANCES》：HPSC-derived mesenchymal stromal cells ameliorate murine autistic-like phenotypes through activating oxytocinergic neurons

　　

孤独症谱系障碍（ASD）是一种遗传性神经发育障碍，以社交缺陷、重复行为和精神共病为特征。尽管其全球患病率不断上升，有效治疗仍然难以实现。间充质基质细胞（MSCs）为ASD提供治疗前景，但其机制尚不清楚。在本研究中，研究人员表明，诱导多能干细胞（iPSC）来源的MSCs可减轻Shank3B敲除小鼠（一种单基因ASD模型）的焦虑、梳理和社交损伤。静脉输注的MSCs定位于神经垂体，与产生催产素（OT）的神经元轴突接触，并激活室旁核（PVN）中的OT⁺神经元。MSC治疗还以OT⁺神经元依赖方式减轻BTBR T⁺ Itpr3^tf/J小鼠（一种特发性ASD模型）的孤独症样表型。机制上，MSCs分泌的前列腺素E₂（PGE₂）启动OT⁺神经元激活，而通过短发夹RNA（shRNA）介导敲低PTGS1和PTGES抑制PGE₂产生则削弱其治疗效力。这些发现揭示了MSCs调节OT⁺神经内分泌回路以改善ASD相关行为的机制。

该论文发表于《SCIENCE ADVANCES》。研究背景方面，孤独症谱系障碍（ASD）包括社交沟通困难、重复行为和受限兴趣等神经发育状况，并常伴随运动障碍、焦虑、认知僵化、感觉敏感和注意缺陷等共病。全球患病率约为每100名儿童中1名，且呈持续上升趋势。当前治疗主要包括精神药物、强化行为治疗以及教育和职业支持，但这些干预多针对焦虑和易激惹等相关症状，而非直接针对核心孤独症特征。间充质基质细胞（MSCs）因具有神经保护和免疫调节能力，被认为是ASD潜在治疗途径，但小规模临床试验证据不足，且机制不清。静脉输注细胞还面临血脑屏障（BBB）限制以及肺、脾等外周器官隔离，进入脑实质的数量有限。因此，研究人员探索MSCs是否通过替代性神经激素调节，尤其通过调控OT系统，改善ASD核心症状。OT主要由下丘脑合成，储存于神经垂体（NH；后叶垂体），并由轴突末梢释放入循环；OT系统早期发育紊乱与社交互动损伤及ASD病因相关，鼻内OT给药虽有治疗潜力，但长期每日给药可导致催产素受体（OXTR）脱敏、内化和下调。

研究人员使用人iPSC来源MSCs，在Shank3B敲除小鼠这一单基因ASD模型及BTBR T⁺ Itpr3^tf/J小鼠这一特发性ASD模型中开展静脉输注治疗，结合行为学、组织学和神经调控实验，发现MSCs可改善焦虑、过度梳理和社交损害；MSCs定位于NH，激活PVN中OT⁺神经元，促进OT合成和释放，并以OT⁺神经元依赖方式发挥作用。机制上，MSCs分泌的PGE₂参与启动OT⁺神经元激活，敲低PTGS1和PTGES削弱治疗效果。该研究的重要意义在于，据研究人员所知，这是首项在孤独症小鼠中建立MSC治疗与催产素能信号神经调控之间因果关系的研究，提示MSC治疗可作为非侵入性策略持续增强内源性OT水平，改善ASD相关社交功能障碍和共病焦虑。

关键技术方法概述如下，不超过250字：样本来源包括3株人iPSC系，相关实验经中山大学伦理委员会批准；Shank3B KO和OT-Cre小鼠购自Jackson Laboratory，BTBR T⁺ Itpr3^tf/J小鼠由S. Shi提供并饲养于华南农业大学，C57BL/6小鼠购自GemPharmatech。主要方法为将iPSC来源MSCs静脉输注至Shank3B KO、Shank3B^?/?;OT-Cre^+/?及BTBR小鼠，设人皮肤成纤维细胞（HDFs）和PBS对照；采用旷场、高架十字迷宫、三箱社交和3D行为图谱分析；结合免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）、透射电子显微镜（TEM）、光纤钙成像、化学遗传学DREADD、脑立体定位注射、VTA内OXTR拮抗、shRNA敲低PTGS1/PTGES、qRT-PCR和Western blot。

研究结果如下。第一，“MSC therapy substantially alleviates autistic-like phenotypes in Shank3B knockout mice”：研究人员在3周龄和7周龄分别静脉给予1×10⁶ MSCs、1×10⁶ HDFs或等体积PBS，末次治疗后1周进行行为学检测。Shank3B KO小鼠存在运动缺陷，MSC对其运动能力影响有限；但MSC治疗增加高架十字迷宫开臂停留时间，提示抗焦虑效应；在三箱社交测试中，MSC治疗小鼠表现出与野生型相似的社交伙伴偏好和社会新颖性识别，而PBS和HDF治疗组无此类社交偏好。PBS和HDF行为相似，提示MSC益处来自其特定治疗属性。单侧迷走神经切断未显著改变同侧PVN中c-Fos与OT⁺神经元共定位、血清OT水平及运动、焦虑和社交行为，提示肺迷走脑轴参与有限。第二，“MSC therapy effectively mitigates stereotyped repetitive behaviors in Shank3B KO mice”：研究人员使用多视角3D动物运动捕捉系统和Behavior Atlas机器学习框架，对自由活动小鼠进行无偏行为分析，从40个行为表型中识别出rising及grooming type 1和type 2。MSC治疗减少Shank3B KO小鼠rising行为，并显著减少自我梳理行为，提示MSC可缓解焦虑样表型和重复/过度梳理。第三，“Intravenously infused MSCs elicit activation of OT neurons within the PVN”：mCherry标记MSCs静脉输注后在移植后6小时、第1天、第3天和第7天持续存在于垂体，并与OT⁺神经纤维密切关联；免疫染色显示MSC移植后4小时，c-Fos和p-CREB仅在OT⁺神经元而非AVP⁺神经元中被诱导。光纤钙成像显示MSC注射后PVN OT⁺神经元钙活动持续升高。第四，“MSC treatment facilitates OT synthesis and release”：MSC治疗后血浆OT水平最早在1天升高并至少维持28天，脑实质和脑脊液OT水平升高，AVP水平变化很小；OT⁺神经元数量或免疫荧光强度未增加；原位杂交显示OT mRNA在1天升高、7天达峰并至少维持28天；TEM显示MSC增加NH轴突中大型密核心囊泡（LDCV）数量。研究还发现MSC治疗增加全脑及PVN、海马（HIP）、腹侧被盖区（VTA）等社交相关脑区OXTR表达，并确认PVN OT⁺神经元至VTA投射；向VTA持续递送OXTR拮抗剂L-368,899可部分削弱MSC的抗焦虑和抗孤独症样效应。第五，“Chemogenetic activation of OT⁺ neurons within the PVN facilitates social behaviors in Shank3B KO mice”：研究人员在Shank3B^?/?;OT-Cre^+/?小鼠PVN双侧注射Cre依赖DREADD-hM3Dq或mCherry对照，并以CNO激活OT⁺神经元，发现血浆OT升高，开臂时间增加，三箱社交有增强趋势，运动表现无显著差异，提示增强PVN OT⁺神经元活动足以减轻孤独症样表型。第六，“Chemogenetic inhibition of OT⁺ neurons compromise anti-autistic effects of MSC therapy”：通过hM4D(Gi)抑制PVN OT⁺神经元后，MSC诱导的血清OT升高以及开臂和三箱社交行为改善被减弱，提示OT信号是MSC治疗效应的重要中介。第七，“MSC therapy alleviates autistic-like phenotypes specifically in BTBR mice exhibiting a substantial increase in OT levels”：在BTBR小鼠中，MSC治疗后一部分表现出血浆OT显著升高，称为OT high，另一部分几乎不升高，称为OT low；OT high组PVN中OT与c-Fos、p-CREB共表达增加，并改善社交互动，而OT low组无行为改善；MSC不影响BTBR小鼠旷场运动，且BTBR在EPM中焦虑水平相对较低。第八，“PGE₂ derived from MSCs induces OT⁺ neuron activation”：研究人员整合小鼠下丘脑PVN单细胞RNA测序与MSC分泌组数据，发现PGE₂受体4（EP4）在PVN OT⁺神经元中选择性高表达；通过shRNA敲低PTGS1和PTGES降低MSC中PGE₂产生后，MSC^{PTGS1?/PTGES?}不能升高血浆OT，且抗焦虑和社交改善效应受损，提示PGE₂分泌部分贡献MSC行为益处，但仍需直接验证其对OT⁺神经元的选择性作用。

讨论部分总结：ASD现有药物缺乏特异性，不针对潜在疾病机制。该研究表明，静脉给予MSCs可减轻单基因或特发性孤独症小鼠的社交损害、过度梳理和焦虑样行为；输注MSCs分布于NH并恢复失调的催产素能信号。NH属于室周器官，具有窗孔毛细血管且缺乏内皮屏障，使外周循环与中枢神经系统可直接交流，从而允许MSCs及其分泌因子与下丘脑神经元投射相互作用。外源OT长期高剂量可致受体脱敏，而MSC治疗通过激活OT⁺神经元促进内源性OT释放，可能避免此类副作用。研究人员此前发现MSC可经肺迷走脑轴缓解焦虑，但本研究中单侧迷走神经切断未显著减少血清OT或阻断MSC行为改善，提示该轴在当前实验背景下作用有限。研究人员提出治疗二分性可能与疾病特异性中枢病理有关，属于情境依赖的适应性反应，而非广谱治疗框架，需在更多疾病模型和独立队列中验证。OT可诱导长时程增强并增强树突棘和突触可塑性，PVN OT⁺神经元是中枢OT主要来源，因此MSC可能通过OT信号挽救Shank3B KO小鼠受损突触连接。BTBR中低基线OT者更可能对MSC治疗反应，可能与OT⁺神经元失代偿或OT回路畸形有关，并反映ASD治疗反应的临床异质性，强调基于OT等生物标志物分层的重要性。机制上，PGE₂由PTGSs和PTGESs等限速酶调控合成，可刺激神经元激活；MSC来源PGE₂已是MSC治疗的重要功能效应因子之一，但直接电生理记录或单神经元功能证据仍缺乏。其他分泌因子如BDNF、VEGF、SLIT3和外泌体也可能影响突触可塑性和社交行为，PGE₂信号的安全性和脱靶作用仍需评估。研究局限包括所有行为和机制数据仅来自雄性小鼠，未涵盖OT回路功能和MSC治疗反应性的潜在性别差异。

研究结论翻译：总之，该研究表明，MSC给药通过增强OT系统有效减轻孤独症小鼠的焦虑样症状和异常社交行为。当前研究中的所有行为和机制数据均仅来自雄性小鼠，排除了OT回路功能和MSC治疗反应性中潜在性别依赖性变异。据研究人员所知，这是首项在孤独症小鼠中建立MSC治疗与催产素能信号神经调控之间因果关系的研究。机制上，MSC来源的PGE₂作为必要的旁分泌介质驱动PVN OT⁺神经元激活，尽管选择性细胞特异性PGE₂–OT神经元相互作用仍需进一步直接验证。