《SCIENCE ADVANCES》：Citron kinase activity controls alternative splicing events that drive prostate cancer growth
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前列腺癌（CaP）仍是男性癌症死亡的主要原因，这凸显了从机制层面开发新疗法的必要性。研究人员此前已确定有丝分裂激酶citron（CIT）激酶的促癌作用及其作为CaP进展关键驱动因子与治疗靶点的潜力，但选择性CIT抑制剂尚不可用。研究人员因此探究：更深入理解执行
前列腺癌（CaP）仍是男性癌症死亡的主要原因，这凸显了从机制层面开发新疗法的必要性。研究人员此前已确定有丝分裂激酶citron（CIT）激酶的促癌作用及其作为CaP进展关键驱动因子与治疗靶点的潜力，但选择性CIT抑制剂尚不可用。研究人员因此探究：更深入理解执行CIT激酶作用的CIT底物，能否带来间接干扰CaP进展中CIT活性的新策略与替代靶点。鉴于CIT底物中可变剪接（alternative splicing）功能显著富集，研究人员聚焦RNA剪接调控因子THRAP3这一代表性底物。CIT对THRAP3的直接磷酸化决定了THRAP3对CIT所控制的前体信使RNA（pre-mRNA）目标的RNA结合能力。交联免疫沉淀测序（CLIP-seq）鉴定出一群CIT依赖的THRAP3结合基因，这些基因优先参与细胞增殖。THRAP3的RNA结合在CaP进展过程中发生可变剪接的基因中富集。CIT依赖的THRAP3结合转录本可刺激CaP细胞系、异种移植瘤、患者来源类器官（PDO）及患者来源异种移植（PDX）来源类器官的生长，而同一基因上CIT非依赖的THRAP3结合转录本无此作用。一种可阻断THRAP3招募至某CIT依赖RNA结合位点的反义寡核苷酸（ASO）能抑制不同CaP阶段与谱系细胞系及PDXO的生长，且不作用于良性细胞。因此，CIT介导的可变剪接驱动CaP进展，抑制该过程是治疗耐药CaP的新策略。
论文解读：《SCIENCE ADVANCES》发表CIT激酶通过THRAP3调控可变剪接驱动前列腺癌进展研究
研究背景方面，转移性前列腺癌（CaP）治疗获得性耐药是患者死亡主因。当前疗法多以雄激素受体（AR）为核心，去势治疗（ADT）及后续高阶药物仅带来短期缓解，去势抵抗性CaP（CRPC）与神经内分泌CaP（NEPC）仍不可治愈。近期磷酸化蛋白质组学显示多种激酶与侵袭性CaP及耐药相关，但控制CaP进展中特异磷酸化标记的激酶大多未知，且大量人类激酶研究不足、缺乏特异性抑制剂。研究人员此前发现CIT（citron kinase）是CaP增殖与致死性进展的关键驱动因子，其促癌完全依赖激酶活性；但选择性CIT抑制剂难以开发，因此有必要从CIT底物角度寻找间接干预路径。由于约37%的CIT底物参与可变剪接，而可变剪接是侵袭性CaP标志且受磷酸化严密调控，研究人员提出：靶向CIT磷酸化底物所控制的剪接机制，可能成为晚期CaP新治疗方向。
主要关键技术方法包括：使用可多西环素诱导shRNA沉默CIT的LNCaP细胞开展CLIP-seq以绘制THRAP3 RNA结合图谱；以rMATS分析RNA-seq数据中的可变剪接事件（SE、MXE、RI、A3′SS、A5′SS）；通过体外激酶实验与定点突变（S243A、S379A）验证CIT对THRAP3直接磷酸化；利用RNA pull-down与decoy RNA及反义寡核苷酸（ASO）阻断THRAP3招募；样本上涵盖CaP细胞系（LNCaP、VCaP、C4-2、42FENZR等）、良性RWPE-1与293T细胞、根治性前列腺切除新鲜组织来源患者来源类器官（PDO）、LuCaP 86.2 PDX来源类器官（PDXO）及裸鼠异种移植模型。
研究结果如下。
CIT’s kinase activity is critical for CaP growth and progression：研究人员通过可诱导激酶死亡型CIT（CIT-KD，K126A）异种移植模型证明，抑制CIT激酶活性显著延迟CaP进展；体外肽阵列与激酶底物图谱给出CIT一致共识基序，且多名点磷酸化标记在CRPC临床磷酸化组富集，证实CIT激酶动作与耐药进展相关。
Spliceosome component THRAP3 is a direct CIT substrate：体外激酶实验确认CIT直接磷酸化THRAP3的S243与S379，其中S243在耐药标本中富集且为核心位点；THRAP3缺失模拟CIT沉默的抗增殖效应，过表达THRAP3可部分挽救CIT沉默表型。
CIT-induced THRAP3 phosphorylation stimulates CaP growth：S243A突变体不再促进CaP细胞活力与Ki67增殖信号，S379A无此主导效应；说明CIT依赖的THRAP3 S243磷酸化是CaP生长关键。
CIT controls THRAP3’s RNA binding：CLIP-seq显示CIT沉默后311个THRAP3结合基因受影响，300个结合减弱；CIT依赖磷酸化控制THRAP3核定位及对其前体mRNA（如CPT1A、AMACR、PRUNE2、FN1）的结合，S243A削弱该RNA结合。
CIT-dependent phosphorylation controls THRAP3-dependent splicing events：过表达野生型THRAP3与S243A引发不同可变剪接程序，两者调控基因集几乎不重叠；GO生物学过程分析表明野生型THRAP3控制的剪接参与细胞周期相关进程。
CIT- and THRAP3-dependent transcripts preferentially stimulate CaP growth：CIT依赖THRAP3结合基因富集于染色体分离、有丝分裂微管组织等增殖过程；THRAP3丢失改变约1400个可变剪接事件。以CPT1A为例，CIT/THRAP3依赖的CPT1A v2比非依赖v1更能重塑增殖相关基因集，且两者依赖基因与THRAP3依赖基因高度重叠。
CIT- and THRAP3-dependent transcripts preferentially control CaP progression：THRAP3结合基因在局限CaP、CRPC、NEPC的可变剪接基因集中渐进富集；过表达CPT1A v2或ESYT2 v1促进细胞活力、Ki67阳性率、异种移植生长及PDO/PDXO扩增，而v1抑制生长。
Overexpression of THRAP3 RNA binding sequences inhibit CaP growth：MEME析出CIT依赖THRAP3 RNA基序；3×基序decoy RNApull-down验证THRAP3结合，S243A结合减弱。decoy与ASO（磷硫酰骨架、靶向CPT1A前体mRNA中THRAP3招募位点）在纳摩尔级抑制ADT初治、CRPC及NEPC细胞系与LuCaP 86.2 PDXO生长，不抑RWPE-1；ASO与恩杂鲁胺或多西他赛有相加效应，并降低CPT1A v2及THRAP3在CPT1A pre-mRNA上的结合。
讨论部分总结：研究人员指出，AR通路耐药后缺乏机制迥异的疗法；CIT作为AGC家族丝/苏氨酸激酶，经THRAP3磷酸化把激酶信号转译为促癌可变剪接程序，是CaP特异且具治疗窗口的靶点。THRAP3并非靠mRNA总量、而靠S243磷酸化状态调度剪接；CIT/THRAP3/CPT1A v2轴揭示“激酶—剪接因子—致癌转录本”新机制。ASO策略相对CPT1A催化抑制剂（etomoxir、perhexiline）可阻断无酶活变异体产生，且借鉴已获批剪接ASO的人用安全性；但本研究仅深入一个CIT底物，临床前仍缺体内长程给药与递送优化。
研究结论部分翻译：CaP死亡源于转移病治疗获得性耐药。AR仍是转移CaP治疗主靶；ADT致缓解但终失效，CRPC可续用AR药物短暂缓解，少数患者演变为AR非依赖NEPC仍不可治。亟需针对耐药所绕开机制的新疗法。本研究显示CIT依赖THRAP3 RNA结合满足此类疗法标准：CIT是驱动致死CaP与耐药的AGC激酶，其激酶活性关键；CIT互作蛋白中大批属主要剪接体，控制从良性、初治CaP、CRPC到NEPC渐进富集的可变剪接。THRAP3为主要剪接体组分，其沉默或过表达分别模仿CIT抑制或促增殖效应，且不伤良性细胞；CIT直接磷酸化THRAP3 S243与S379，仅S243决定促生长功能并维持THRAP3核定位与pre-mRNA结合。CIT/THRAP3依赖转录本来自耐药进展中发生可变剪接的基因并优先促增殖。该工作首次给出由中枢介质CIT底物协调控制治疗耐药CaP可变剪接、且逆转可延缓进展的机制；并借decoy RNA与ASO证明阻断CIT依赖THRAP3结合位点为晚期CaP可提供新治疗路径。
