《Cogent Food & Agriculture》：Existing and emerging in vitro and in vivo methods for protein and amino acid assessment in foods: a systematic review of methodological advances, validation, and predictive performance
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蛋白质与氨基酸评估是营养学、食品配方及监管评价的核心环节，尤其在新型和可持续蛋白质来源不断扩展的背景下尤为重要。本系统综述整合了2016–2026年间关于蛋白质数量/质量、氨基酸组成及消化率测定方法的证据，重点聚焦方法学比较、验证及预测性能。证据
摘要专业翻译
蛋白质与氨基酸评估是营养学、食品配方及监管评价的核心环节，尤其在新型和可持续蛋白质来源不断扩展的背景下尤为重要。本系统综述整合了2016–2026年间关于蛋白质数量/质量、氨基酸组成及消化率测定方法的证据，重点聚焦方法学比较、验证及预测性能。证据覆盖基于氮的测定方法、氨基酸水解与色谱分析、静态与动态体外消化、体内回肠消化率、DIAAS与PDCAAS、光谱学、肽组学、微流控及人工智能（AI）技术。氨基酸分析方法报告的回收率约为90–105%，相对标准偏差（RSDs）通常低于约3–8%；而光谱学/AI研究普遍报告的R2值约为0.85–0.99。部分体外验证研究报告的相关系数高于r = 0.8，但这些结果具有基质特异性，并未确立一致性或排除系统性偏差；部分体外与体内消化率估计值之间报告的配对差异约为5–15%，同样随基质和方案而变化。上述发现表明，分析准确性、与参考方法的一致性、生物学有效性及监管有效性属于不同的证据域。持续存在的不确定性来源包括基质效应、非蛋白氮、不完全或差异性的氨基酸回收、消化模型假设、实验室间变异、AI模型外部验证不足，以及体外研究结果向人体生理利用转化不完整。因此，本综述支持一个分阶段证据框架：化学测定为氨基酸回收、消化率估计及DIAAS计算提供输入，随后在用于最终营养或监管决策之前，须针对生理结局进行验证。
论文主体内容总结
1. 引言
论文引言指出，蛋白质和氨基酸谱评估是现代食品科学、人类营养及公共卫生政策的重要基石。随着全球人口增长、气候变化和可持续生产需求推动蛋白质来源多样化（从传统动物性食品扩展到植物基替代品、昆虫、微生物蛋白及精准发酵成分），准确且具有生理相关性的评估方法日益重要。蛋白质质量既取决于必需氨基酸组成，也取决于这些氨基酸可被吸收利用的比例。尽管PDCAAS提供了实用的历史框架，但其使用粪便蛋白质消化率并在100%处截断，限制了对不同氨基酸特异性消化率蛋白质的区分能力。因此，FAO于2013年推荐采用DIAAS，后续研究强调需在参考氨基酸模式、内源性损失校正、食品加工、基质效应及高质量回肠消化率数据可及性的背景下解读DIAAS。生长猪是重要的生理参考模型，但猪源消化率值不应直接等同于人体吸收后利用或代谢结局。与质量评分变化并行，体内外方法均取得了实质性方法学进展。静态和动态消化方案（尤其是INFOGEST）为机制筛选和比较提供了标准化实验条件。然而，体外消化率终点代表模型依赖的消化或氨基酸生物可及性估计，不应视为人体吸收或利用的直接测量。分析技术进步（如UHPLC-MS/MS、改进的水解方案和基质特异性氮-蛋白转换因子）可提高测量精度，但更好的分析精度本身并不能确立更强的营养预测有效性。新兴技术进一步扩展了分析工具箱，包括SERS、微流控装置、高分辨率肽组学、便携式近红外光谱和AI辅助光谱分析，但这些技术对营养评估的价值取决于校准域、参考方法质量、外部验证、基质稳健性、可重复性及与生理有意义终点的关联。尽管有这些进展，重要空白仍然存在：实验室间标准化不完整；体外消化终点与人体生理之间的关系需跨食品基质和生命阶段验证；监管方法持续演变。综述的核心未决问题不仅是方法学增殖，而是缺乏协调且经过验证的关系，将分析测量、氨基酸回收、消化率、DIAAS与人体生理利用联系起来。综述概念框架围绕四个关键证据域设计：分析测量、氨基酸特异性回收与消化率、蛋白质质量指标、生物学利用与人体生理结局。早期阶段引入的误差或不确定性可传播至后续阶段。
2. 方法
本系统综述遵循PRISMA 2020声明及PRISMA-S建议进行。因纳入研究在食品基质、实验设计、参考方法、终点和报告尺度上差异显著，未进行荟萃分析，但通过提取研究报告范围的回收率、精密度、检出限、相关系数、R2和预测误差进行了叙述性结构化定量综合。文献检索覆盖PubMed/PMC、Scopus、ScienceDirect、Web of Science、Wiley Online Library、Taylor & Francis Online、MDPI Journals、Frontiers和SAGE Journals，Google Scholar作为补充来源，并手工检索FAO、WHO、EFSA、USDA和FDA的组织报告与立场文件。检索时间为2026年2月至2026年9月。检索策略结合受控词汇和自由文本关键词，包括蛋白质质量、氨基酸谱、氨基酸分析、蛋白质消化率、DIAAS、PDCAAS、体外消化、INFOGEST、回肠消化率、蛋白质水解、Kjeldahl、Dumas、质谱氨基酸、近红外蛋白质和新型蛋白质评估等组合，限定2016至2026年英文出版物。纳入标准为2016至2026年间发表的原创研究或高质量系统/范围/批判性综述，聚焦人类食品中蛋白质定量、氨基酸谱分析、蛋白质消化率或蛋白质质量评估方法的开发、验证、进展或应用，并报告原始数据或对常规、新型或替代食品基质的关键综合。初步检索获得814条记录，筛选后94项研究符合纳入标准。三名评审员独立筛选标题和摘要，分歧通过讨论和共识解决。标准化数据提取表经10项研究试点，提取字段包括作者、年份、研究类型、国家、食品基质、方法、技术参数、准确性、精密度、回收率、与参考方法的相关性、预测误差、主要发现、局限性及对蛋白质质量评估的意义。质量评估和偏倚风险评估按研究设计进行：系统综述采用AMSTAR 2，官方方法和共识方案依据AOAC标准方法性能要求评估，主要分析研究采用改编的JBI检查表及Eurachem和AOAC验证标准，动物研究采用SYRCLE，人类非随机研究采用ROBINS-I，叙述性综述采用SANRA或JBI文本与意见检查表。质量评级操作定义为高、中、低和极低。光谱学和机器学习研究接受校准设计、训练/测试分离、外部验证、不确定性估计、基质可转移性和过拟合的额外审查。
3. 结果与讨论
纳入的94篇参考文献方法学质量差异显著。约28篇（30%）被评为高质量，集中于官方方法、共识消化方案和描述完善的生理参考研究，而新兴光谱学、机器学习和探索性计算研究更常存在外部验证、基质可转移性或报告完整性方面的担忧。约18–20篇参考文献偏倚风险被评为低，主要为AOAC官方方法、INFOGEST共识方案和FAO专家报告。最大群体（约60%）被评估为存在一些担忧，常见问题包括动物研究中随机化和分配报告不完整、分析和光谱方法中的基质或校准限制、人类研究中混杂因素报告不完整、叙述性综述中选择性或覆盖不完整。10–15篇参考文献被判定为高偏倚风险，主要为非同行评审论文和海报、验证细节稀疏的低影响力成分研究以及纯计算论文。
3.1 食品中蛋白质和氨基酸谱测定/分析背后的化学、原理与机制
Kjeldahl法依赖浓硫酸消化（通常420至450°C，使用Cu、Se或Hg催化剂）将有机氮转化为硫酸铵，中和后蒸馏并通过滴定定量。Dumas燃烧法涉及高温（≥950°C）氧气热解，将所有氮转化为NOx，随后还原为N2气体通过热导检测。两种方法最终报告总氮，使用转换因子（通常6.25，但食品基质特异性值范围4.59至6.38）转换为蛋白质。酸水解（6 M HCl，110°C，24小时）质子化肽键羰基氧，促进水亲核攻击和断裂。碱水解（4–5 M NaOH）去质子化酰胺氮，促进键断裂，对色氨酸有效但对其他氨基酸具破坏性。过甲酸氧化后酸水解将半胱氨酸转化为半胱磺酸、甲硫氨酸转化为甲硫氨酸砜以准确量化。酶水解使用蛋白酶在温和条件下进行但释放不完全。柱前衍生化添加发色团或荧光团增强紫外/荧光检测；未衍生化LC-MS/MS利用质子化或加合物形成进行质量选择性检测。美拉德反应涉及羰基-胺缩合，形成Amadori产物、晚期糖化终产物（AGEs）和交联，减少可利用赖氨酸并改变消化率。非蛋白氮（核酸、尿素、硝酸盐）使Kjeldahl/Dumas结果膨胀。外消旋化（L-至D-氨基酸）在碱性条件下发生。Dumas提供更优速度和安全性，在大多数食品基质中与Kjeldahl结果相当，但两者均因非蛋白氮高估真实蛋白质。优化的小规模酸水解与添加剂实现大多数氨基酸>90%回收率。食品特异性转换因子显著提高准确性。肽组学揭示体外消化过程中肽释放模式比总氨基酸含量更好地反映生物利用度。
3.2 蛋白质消化率和氨基酸谱测定的主要体外方法比较：近期更新、原理、方法与应用
体外方法使用标准化酶、pH、温度和转运时间模拟人体胃肠道理化条件。静态模型对各阶段使用固定条件，动态模型纳入pH、酶分泌和蠕动的渐进变化。协调的INFOGEST方案已成为最广泛采用的静态方法，近期扩展支持直接计算体外DIAAS。INFOGEST静态方案始终低估消化率，与体内猪数据相比多数基质低5至15%。INFOGEST Quant对乳制品蛋白与猪回肠消化率显示可接受相关性，但对高纤维植物和新型蛋白表现不佳。动态模型（TIM-1、SHIME）更好地捕捉转运时间和微生物发酵，但实验室间可重复性差。体外DIAAS值系统性低于体内DIAAS，尤其对植物基和昆虫蛋白。小型化INFOGEST版本减少样品需求但损害生理相关性。Caco-2细胞整合改善吸收洞察但引入高变异性。微流控消化芯片承诺高通量但缺乏针对标准化模型的验证。静态模型高估富含几丁质昆虫蛋白的消化率。植物基肉类类似物显示高度可变的体外消化率。挑战包括高抗营养因子食品中的持续基质效应、刷状缘酶模拟有限、个体消化变异考虑不足、过度依赖乳制品验证基准、混合餐表现差、老年和婴儿消化模拟数据不足、加工高脂基质相关性弱、胆汁盐浓度标准化不足、低估结肠发酵影响以及整体未能准确预测多样化可持续蛋白质来源的真实人体蛋白质利用。
3.3 蛋白质消化率和氨基酸谱测定的体内方法：近期更新、原理、方法与应用
体内蛋白质消化率评估测量摄入氮或氨基酸在小肠结束前从胃肠道消失的比例（回肠消化率）或未通过粪便排出的比例（粪便消化率）。真回肠消化率校正基础内源性损失，更准确反映膳食蛋白质可及性。回肠插管或回肠造口模型允许直接量化单个必需氨基酸的吸收。生长猪模型因解剖、生理和代谢相似性被广泛接受为优选非灵长类模型。标准化回肠插管方案已细化，T型套管和阀后盲肠T型套管（PVTC）技术使用增加。多项研究确定了乳制品、肉类、植物、昆虫和新型蛋白中氨基酸的标准回肠消化率（SID）。人类双同位素方法（如使用15N标记蛋白）作为回肠消化率测量的微创替代方案出现。大鼠模型继续用于蛋白质效率比（PER）和净蛋白质比（NPR），但其对回肠氨基酸消化率的局限性已获认可。PDCAAS因其简单性、历史数据集和某些监管应用仍具相关性，但其限制（粪便而非回肠消化率、使用通用消化率系数、100%截断）可掩盖高质量蛋白质间的差异，并可能在与DIAAS比较时产生分歧。体内消化率研究昂贵、耗时、受伦理约束且难以跨实验室标准化。动物年龄、日粮组成、生理状态和实验方案的可变性影响消化率估计并降低研究间可比性。消化率值本身不能完全捕捉吸收后氨基酸利用、蛋白质合成代谢潜力或食品基质效应。加工条件、成分相互作用和结构修饰可显著改变氨基酸生物利用度，超出常规消化率测量预测的范围。
3.4 可消化必需氨基酸评分（DIAAS）
DIAAS通过评估单个必需氨基酸（IAAs）相对于人类需求的消化率和可及性来量化膳食蛋白质质量。计算公式为：DIAAS（%）= 100 ×（1 g测试蛋白中可消化限制性IAA毫克数）/（1 g参考蛋白模式中相同IAA毫克数）。生长猪模型仍是真回肠消化率（TID）的金标准模型，使用回肠插管猪饲喂以测试食品为唯一蛋白质来源的日粮，校正基础内源性损失后确定IAAs的SID。乳蛋白浓缩物常超过115，而豌豆或大米蛋白范围为40至80，取决于年龄参考模式。INFOGEST静态消化方案已扩展用于蛋白质消化率和体外DIAAS计算。INFOGEST Quant方案标准化未消化物质沉淀，随后对可吸收部分进行氨基酸分析。验证研究显示与猪体内数据在乳制品、植物和昆虫基质中强相关。其他更新包括用于无创人体TID的双同位素方法和精细化参考模式。DIAAS为监管标签、可持续膳食配方和新型食品开发提供信息。混合低DIAAS植物蛋白可提升复合评分。DIAAS通过纳入单个回肠氨基酸消化率提供比PDCAAS更具生理意义的蛋白质质量评估，但食品基质、加工条件和蛋白质来源间的显著变异性凸显了标准化、解释和跨食品系统普遍应用方面的持续挑战。体外消化率在验证基质中常与猪数据良好相关（r > 0.8），但高纤维或富含抗营养因子食品中因刷状缘酶或微生物相互作用模拟不完整而出现差异。监管采用仍渐进：联合国FAO认可DIAAS，而FDA和EFSA等监管机构因数据缺口和实施成本继续过渡性使用PDCAAS。
3.5 蛋白质消化率校正氨基酸评分（PDCAAS）
PDCAAS计算为最低氨基酸评分（测试蛋白必需氨基酸含量与参考模式之比）乘以真粪便蛋白质消化率（%），最终评分在1.00（100%）处截断。参考模式通常基于学龄前儿童（2–5岁）需求。2016至2026年研究一致报告高质量动物蛋白（乳清、酪蛋白、鸡蛋、乳浓缩物等）PDCAAS值为1.00，加工大豆得分可变但通常较高（0.8–1.0），而许多未加工植物来源因限制性氨基酸和降低的消化率得分较低。传统测定依赖大鼠粪便消化率测定，猪和人类研究提供比较数据。近期工作探索使用体外消化率作为计算PDCAAS样值的代理，对乳制品和部分植物基质显示合理相关性，但高纤维食品变异性更大。加工处理（热、挤压、发酵）对PDCAAS的影响已被量化，豆类和谷物中观察到改善。监管机构维持PDCAAS用于实际标签，同时承认DIAAS优势。FAO专家工作组（2017）建议在DIAAS数据不可用时支持PDCAAS用于后续配方和治疗食品。PDCAAS的基本限制在于依赖粪便消化率值，未考虑大肠中氨基酸损失和微生物活动，消化率估计可能无法准确反映身体吸收的必需氨基酸量。100%以上值的截断阻止了高质量蛋白质间的区分，掩盖了氨基酸谱更优蛋白质来源间的营养差异。PDCAAS对所有氨基酸应用单一消化率系数，忽视单个必需氨基酸消化率的变异。尽管PDCAAS对历史比较和监管连续性仍有价值，当前证据强烈支持向DIAAS等更具生理相关性的方法过渡以进行准确蛋白质质量评估。
