互花米草叶际微生物组对叶片损伤的响应：微生物群落组成与丰度的改变

《Microbiology Spectrum》：Leaf damage is associated with alteration of microbiome composition and abundance in the Spartina alterniflora phyllosphere

　　

摘要专业翻译 互花米草（Spartina alterniflora）是美洲大西洋和墨西哥湾沿岸盐沼中的优势植物物种，正受到病害和突发性植被衰退（sudden vegetation dieback）的影响。尽管互花米草在低海拔盐沼中具有基础性生态作用，但叶片损伤（由病害和环境胁迫所致）对原生叶际微生物组（phyllosphere microbiome）的响应尚未被探索。研究人员假设健康和受损植株在初次感染或暴露于环境胁迫后，其叶际微生物组会出现分化。本研究分析了互花米草叶际微生物组中原核生物（prokaryote）和真菌（fungi）相对丰度、多样性及群落组成的变化。研究人员比较了美国佐治亚州和南卡罗来纳州的自然盐沼与温室植株，并从两种暴露于不同环境胁迫的互花米草表型（phenotype）的健康和受损自然植株上采集叶片。结果表明，植株来源（即温室vs自然盐沼）、植株健康状态（即健康vs受损）和植株表型（即矮型vs高型互花米草）均影响互花米草叶际微生物的相对丰度、α多样性（alpha diversity）和群落组成。受损叶片表现出比健康叶片更高的微生物丰度和α多样性，表明叶片损伤后发生了微生物增殖。从种子在温室中培育的植株，其原核生物和真菌群落的微生物丰度及Shannon多样性均最低，表明在自然生态系统中，叶际微生物群主要通过环境水平传播（horizontal transmission）获得。总体而言，本研究为互花米草叶际微生物组的组装提供了新的见解。

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一、研究背景与科学问题

盐沼生态系统是位于低能波区的潮间带湿地，为人类社会提供风暴潮防护、水体净化、碳封存和休闲渔业等多项生态系统服务。然而，全球范围内的滨海生态系统正因沉积物供给不足、海平面加速上升和土地利用变化等环境胁迫而持续退化。互花米草作为美洲大西洋和墨西哥湾沿岸低洼盐沼的优势植物物种，其健康状况直接决定盐沼生态系统的整体功能。近几十年来，美国东南部多次发生大规模植被衰退事件，镰刀菌属（Fusarium）等多种真菌病原体被鉴定为驱动这些衰退事件的重要胁迫因子之一。此外，麦角菌属（Claviceps）和柄锈菌属（Puccinia）的物种也被证实与互花米草病害相关。

尽管已有研究开始利用免培养技术表征互花米草根系及沉积物中的微生物组和病毒组，但对叶片环境（即叶际）中微生物群落的组成及其对叶片损伤和环境胁迫的响应仍知之甚少。在模式植物和农业植物的研究中，微生物感染已被证明会改变叶际微生物组，增加机会性共生菌的丰度并降低α多样性，这种状态被称为微生态失调（dysbiosis）。然而，互花米草叶际是否遵循同样的生态轨迹，以及环境胁迫梯度如何塑造叶际微生物群落组装，均缺乏实证研究。

互花米草的一个重要适应性特征是叶片表面具有专门的泌盐腺，可将盐分排出并在叶片表面形成盐结晶，从而为微生物定殖创造了独特的高盐选择性生境。此外，互花米草群落内部存在随距潮沟距离变化的环境胁迫梯度：远离潮沟的植株根区积累更高浓度的盐分和植物毒性硫化物，表现为矮型表型（株高<100 cm），而胁迫较轻的潮沟头植株可达200 cm以上，表现为高型表型。基于上述背景，本研究旨在明确互花米草叶际微生物组的组成，量化植株健康和叶片损伤对微生物丰度、多样性和组成的影响，阐明叶际微生物组的来源，并鉴定与环境胁迫和叶片损伤相关的原核和真菌类群。

二、研究设计与主要结论

研究人员于2021年和2022年7月互花米草生长高峰期，在佐治亚州两个屏障岛（萨佩洛岛和斯基达韦岛）的自然盐沼样地以及佐治亚州萨凡纳和南卡罗来纳州查尔斯顿的两个温室设施中共采集247片叶片。叶片健康状态依据田间观察分为健康和受损两类：受损叶片呈现病斑、坏死、斑点或可见真菌生长中的一种或多种特征，健康叶片则无可见组织损伤迹象。自然盐沼叶片沿硫化物浓度、盐度和沉积物氧化还原条件构成的环境胁迫梯度采集，涵盖矮型和高型两种表型。温室植株由田间采集的植物学种子（未经消毒）萌发培育，以区分水平传播与垂直传播（vertical transmission）在微生物组招募中的相对贡献。

研究获得的主要结论包括：第一，叶片损伤和环境胁迫显著影响互花米草叶际微生物组的丰度和多样性。在两种表型中，受损叶片的原核和真菌相对丰度均显著高于健康叶片；受损高型表型叶片表现出比健康高型叶片更高的原核Shannon多样性。环境胁迫梯度同样影响微生物群落：健康矮型表型叶片比高型表型具有更高的原核和真菌相对丰度，且矮型表型在受损和健康状态下均表现出更高的原核α多样性。第二，温室植株的叶际微生物丰度和多样性显著低于自然盐沼植株，原核和真菌相对丰度中位数分别仅为0.04%和0.32%，且群落组成与自然植株明显分离，表明互花米草叶际微生物组主要通过环境水平传播获得。第三，差异丰度分析鉴定出与叶片损伤和环境胁迫相关的特定微生物类群。受损叶片富集了来自γ-变形菌纲和α-变形菌纲的多个原核ASV（amplicon sequence variant，扩增子序列变体），包括Kushneria、Pseudoroseicyclus、Altererythrobacter、Stakelama和Kineococcus属。真菌方面，Phaeosphaeria spartinicola在受损叶片和矮型表型中显著富集，其ITS序列与NCBI数据库中的P. spartinicola分离株完全匹配。Fusarium属仅在6个受损叶片样本中被检测到，相对丰度较低，且其中5个为F. palustre。

三、关键技术与方法

本研究采用的主要技术方法包括：基于16S rRNA基因V4区和ITS区域的扩增子测序（amplicon sequencing），分别表征原核和真菌群落组成；使用DADA2流程推断ASV，并分别基于SILVA数据库（版本138.2）和UNITE数据库（版本9.0）进行分类学注释；以Shannon指数衡量α多样性；采用双因素方差分析（two-way ANOVA）和Kruskal-Wallis非参数检验评估健康状态和表型对多样性和丰度的影响；基于Bray-Curtis相异矩阵进行非度量多维尺度分析（NMDS）和置换多元方差分析（PERMANOVA）评估群落组成差异；使用MaAsLin2（Microbiome Multivariable Associations with Linear Models 2）进行差异丰度分析，以鉴定不同条件下显著富集或减少的微生物ASV。

四、研究结果

叶片损伤和环境胁迫影响叶际微生物组的丰度和多样性。 通过比较自然盐沼中健康和受损叶片的微生物相对丰度，研究发现受损叶片在两种表型中的原核和真菌相对丰度均显著高于健康叶片。α多样性方面，受损高型表型叶片比健康高型叶片具有更高的原核Shannon多样性，而矮型表型中无显著差异。PERMANOVA分析表明，原核群落组成主要受植株健康状态影响，其次为植株表型和样点位置；真菌群落组成则主要受植株表型影响，其次为健康状态和样点位置。

温室植株表现出较低的微生物丰度和多样性及独特的叶际微生物组。 与自然盐沼的健康植株相比，温室植株的叶际原核和真菌相对丰度均显著更低，原核多样性低于矮型表型，真菌多样性低于高型和矮型两种自然表型。NMDS排序和PERMANOVA分析显示，温室植株的叶际微生物组在组成上与自然植株明显不同。

叶片损伤和胁迫叶片中富集的微生物类群鉴定。 差异丰度分析显示，受损叶片中富集了Kushneria、Pseudoroseicyclus、Altererythrobacter、Stakelama和Kineococcus等属的原核ASV。健康矮型表型富集了未分类蓝藻纲和Erythrobacter、Palleronia–Pseudomaribius属的ASV，而健康高型表型仅富集了Candidatus Uzinura属的一个拟杆菌纲ASV。真菌方面，P. spartinicola在受损叶片和矮型表型中显著富集；受损高型表型富集了Papiliotrema mangalensis、Cladosporium cladosporioides、Aureobasidium、Penicillium和Puccinia属的ASV，受损矮型表型则富集了P. spartinicola和未分类属的ASV。

五、讨论与结论

本研究发现互花米草叶际微生物组中最丰富的细菌属包括Salinisphaera、Salinicola、Salinimonas、Kushneria和Erythrobacter等具有嗜盐生长适应性的类群，表明该叶际生境除面临寡营养、高紫外辐射和低水分可用性等常见叶际胁迫外，还适应了互花米草叶片泌盐形成的高盐条件。最丰富且最普遍的真菌物种为P. spartinicola，这是一种已知的互花米草木质纤维素降解腐生菌，不仅存在于腐烂组织中，也是健康叶片叶际的常见成员。

与以往植物叶际微生态失调研究中观察到的病原菌大量增殖和α多样性降低不同，本研究发现叶片损伤导致微生物丰度和α多样性同时增加，这更符合生态位扩张理论：叶片组织机械损伤释放多种碳底物和营养物质，增加了资源异质性，促进了更广泛微生物类群的定殖。受损叶片中P. spartinicola的高丰度需结合与滨螺（Littoraria irrorata）的互作关系来理解——滨螺在互花米草叶片上的取食损伤促进了该腐生真菌的定殖和叶片分解，而矮型表型中滨螺密度最高，与P. spartinicola在矮型受损叶片中的高丰度一致。

温室植株叶际微生物组的近缺失表明，互花米草叶际微生物组主要通过环境水平传播获得，而非种子垂直传播。潮汐作用和每日盐水淹没可能作为额外的微生物获取途径，高盐沉积物中的微生物通过潮汐水再悬浮可能成为叶际微生物的重要来源。此外，Candidatus Uzinura作为介壳虫的专性共生菌，在高型表型中丰度最高，提示昆虫活动也可能贡献叶际微生物的获取。

基于温室叶片微生物耗竭的发现，研究人员提出在将温室培育的互花米草幼苗移植到野外盐沼之前，利用其叶际尚未被占据的生态位进行有益微生物接种的策略，可能有助于增强植株抵抗病原菌感染的能力。本研究为互花米草叶际微生物组在健康和胁迫条件下的原位基线提供了基准，为未来利用植物相关微生物促进生态系统恢复的研究奠定了基础。