多光谱技术与分子模拟视角下酸奶中酪蛋白与关键香气化合物相互作用的见解

《International Journal of Biological Macromolecules》：Multispectroscopic and molecular simulation insights into the interaction between casein and key aroma compounds in yogurt

　　# 摘要牛乳蛋白（CS）与酸奶关键香气成分之间的分子作用机制目前尚未得到充分阐明。本研究综合运用多光谱技术与分子模拟方法，系统考察了CS与双乙酰、二乙酰和乙醛之间的相互作用。荧光猝灭分析证实，通过静态猝灭机制形成了稳定的基态复合物（K_q ≈ 10¹¹ L·mol^?1·s^?1），其结合亲和力顺序为：双乙酰 > 二乙酰 > 乙醛（298–310 K下K_a在1.12 × 10³–2.82 × 10³ L·mol^?1范围内）。热力学评估（ΔG < 0，ΔH > 0，ΔS > 0）表明，该结合过程为自发的吸热过程，主要由疏水相互作用驱动。值得注意的是，光谱学与形貌表征结果显示，在本征无序的CS基质内部发生了依赖于配体的、各具差异的结构重构。酮类配体（双乙酰和二乙酰）会引发显著的结构解卷曲与颗粒状聚集，而乙醛则促进了紧凑的分子间交联。此外，分子对接与100 ns分子动力学模拟表明，β-CS是主要的结合亚基，它利用其高度灵活的N端结构域，通过疏水塌缩机制动态地包埋香气分子。这些研究结果从原子水平揭示了乳蛋白-风味相互作用，为发酵乳制品中靶向风味调控与保香提供了坚实的理论基础。---# 引言酸奶是全球乳制品市场的重要板块，得益于其营养价值以及广为人知的健康功效。然而，消费者接受度与市场成功最终取决于其感官品质，而风味在其中起着决定性作用。在乳酸菌发酵过程中产生的众多挥发性化合物中，乙醛、二乙酰和双乙酰被公认为酸奶中最核心的特征性香气成分[1]。乙醛赋予酸奶新鲜、青苹果般的香气，是正宗酸奶风味的关键所在。二乙酰带来浓郁的黄油与奶油香气，而它的酶还原产物双乙酰则提供更为温和的黄油风味，从而缓和高浓度二乙酰带来的刺激性。双乙酰、二乙酰和乙醛是赋予乳制品特征风味的重要香气成分。然而，由于它们的分子量小、挥发性高，在热加工与储存过程中容易损失，导致香气强度与风味品质下降。因此，了解它们与牛乳蛋白（CS）之间的相互作用对于改善乳制品的保香性能、维持风味稳定性具有重要意义。尽管这些化合物在原奶中仅以痕量存在，但发酵后它们之间的协同平衡对于发酵乳制品的特征风味至关重要。关键在于，酸奶风味的整体感知不仅取决于这些挥发性化合物的生成，还强烈地受其食品基质中的保留与释放行为所支配[2]。蛋白质是酸奶凝胶网络的主要结构组分，具有与风味分子结合的高度能力，从而调节它们的热力学分配和动力学释放。现代乳制品日益演变为包含多种功能性原料的复杂食品体系，同时还需要经历多种不同的加工处理。因此，食品大分子的结构性组织已成为影响其物理化学功能与风味品质的关键决定因素。近期研究表明，乳制品加工过程中乳糖介导的物理化学反应可能会改变蛋白质的构象和分子相互作用[3]；而生物活性成分的引入进一步增加了功能性食品基质的复杂性[4]、[5]。此外，对食品大分子进行受控的结构重构已被证明可以显著影响其功能表现[6]；新兴的非热技术也展现出在加工过程中保持基质完整性和感官品质的巨大潜力[7]。在这些大分子中，由于其独特的结构特征，CS在决定香气的保留与释放方面发挥着核心作用。CS约占乳蛋白总量的80%，构成酸奶基质的基础骨架。由于该蛋白属于缺乏刚性三维折叠的本征无序蛋白，表现出非凡的结构灵活性。这种动态构象对于维持乳制品体系的物理化学稳定性起着关键作用，并不可避免地决定其与挥发性化合物的结合相互作用。在原奶中，CS并非以孤立的肽链形式存在，而是自组装成称为CS胶束的球形胶体聚集体（直径50–500 nm），其稳定性依赖于四种不同亚基的层次化分布与协同相互作用：αs1-CS（约38%）、αs2-CS（约10%）、β-CS（约36%）和κ-CS（约13%）。对钙敏感的αs1-、αs2-和β-CS亚基主要嵌于胶束内部，通过胶束磷酸钙纳米簇交联，形成动态的、多孔的疏水网络。相比之下，κ-CS专门锚定于胶束表面，其糖基化的C端结构域伸入水相，形成亲水的"绒毛层"，提供空间排斥作用，防止胶束发生不可逆聚集。在结构上，所有CS亚基均属于本征无序蛋白，但它们在疏水性、磷酸化程度和构象柔性方面差异显著，这直接塑造了它们的风味结合能力。β-CS表现出最强的两亲性：其高度带电荷的N端区域具有亲水性，而C端则密集分布着疏水残基，形成易于接近的疏水空腔，有利于与疏水性小分子发生非共价相互作用。α-CS（以αs1和αs2异构体为主）含有更多的磷酸化丝氨酸残基，表面疏水性相对较低；而位于胶束周缘的κ-CS内部疏水结构域有限，但可能通过极性相互作用参与风味化合物的表面吸附。这些亚基定位与物理化学性质的固有差异，直接决定了结合位点的可及性以及整个CS基质的整体保香性能[8]。尽管CS在保香方面起着关键作用，但CS与这些关键酸奶香气分子之间的具体相互作用机制仍未得到充分认识。关于乳蛋白-风味相互作用的现有文献主要集中于乳清蛋白或单一的CS分离组分[9]。对于其他本征无序食品蛋白也报道了类似的相互作用行为。由于具有柔性构象且缺乏稳定的三级结构，本征无序蛋白通常会暴露出动态的疏水区域，易于与挥发性香气成分相互作用。以往研究已表明，β-CS主要通过疏水相互作用与疏水性风味化合物形成强结合亲和力，并通过氢键结合[4]、[5]。然而，系统阐述整个CS复合物如何与具有不同官能团、极性和链长的酸奶主要香气成分相互作用的详细研究明显匮乏。特别是，特定香气化合物的分子结构与其随后引发的CS构象响应之间的关系，在宏观实验和原子水平上尚未得到充分阐明。为弥补这一知识空白，并全面阐明CS与关键香气化合物（乙醛、二乙酰和双乙酰）之间的相互作用机制，本研究采用了实验与计算相结合的方法。采用紫外-可见（UV–Vis）吸收光谱、荧光光谱、气相色谱-氢火焰离子化检测（GC-FID）、傅里叶变换红外（FTIR）光谱和圆二色（CD）光谱来表征结合亲和力与构象重排。此外，整合分子对接和分子动力学（MD）模拟，以在分子水平上可视化蛋白-香气复合物在分子层面的结合位点、相互作用力与动态稳定性。本研究旨在为深入理解本征无序蛋白与挥发性化合物之间的结构-相互作用关系提供深刻的理论见解，最终为发酵乳制品中靶向保香的调控提供分子基础。---# 章节片段## 材料双乙酰（CAS No. 513–86-0，≥95%）、二乙酰（CAS No. 431–03-8，≥99%）和乙醛（CAS No. 75–07-0，40%水溶液）购自泰坦（中国上海）。CS（主要由α-、β-和κ-CS组成）（CAS No. 9000-71-9，纯度≥92%）购自伊纳凯（中国上海）。商用CS制剂通过酸沉淀法从牛乳中提取，沉淀接近等电点，随后进行洗涤和干燥处理。所得全酪蛋白包含……## CS对双乙酰、二乙酰和乙醛的结合能力如图1A所示，在环境温度条件下，CS对所有三种香气化合物均表现出一定的结合能力，而结合率随香气化合物浓度的增加而逐渐降低。这一发现表明，CS上可用的结合位点有限，在高浓度条件下结合趋于饱和，从而增加游离香气化合物的比例[15]。这些结果与先前的研究一致。## 结论本研究系统阐明了全CS与三种特征性酸奶香气化合物（双乙酰、二乙酰和乙醛）之间的相互作用机制。结合亲和力顺序为：双乙酰 > 二乙酰 > 乙醛，突出了香气分子的几何构型与官能团在调控蛋白-风味关联中的决定性作用。热力学分析表明，该相互作用为自发的吸热过程，主要由……## CRediT作者贡献声明**唐灿：** 撰写——初稿、调查研究、数据整理。**杨畅：** 软件、方法学。**李辉：** 形式分析。**陈陈：** 方法学、形式分析。**余海燕：** 软件。**楼馨曼：** 形式分析。**潘馨：** 调查研究。**田华翔：** 资金获取。**袁海斌：** 监督、项目管理。**李洪亮：** 资源、资金获取。## 未引用的参考文献[35]、[36]、[37]、[38]## 利益冲突声明没有需要声明的利益冲突。## 致谢本研究得到**国家自然科学基金**（编号：32502397）、**上海市科学技术委员会**（编号：25ZR1402477）、**上海市农业农村委员会项目**（编号：T2025302）以及**上海市科学技术委员会上海市工程技术研究中心**（编号：20DZ2255600）的资助。---**作者：** 唐灿 | 杨畅 | 李辉 | 陈陈 | 余海燕 | 楼馨曼 | 潘馨 | 田华翔 | 袁海斌 | 李洪亮