《Nucleic Acids Research》：Wavelet-based whole genome doubling aware single-cell copy number calling
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单细胞全基因组测序（single-cell whole genome sequencing，scWGS）进展使得以最小测序偏差对数千细胞的拷贝数状态进行刻画成为可能。Direct Library Preparation+（DLP+）是一种无全基因组扩增的scW
单细胞全基因组测序（single-cell whole genome sequencing，scWGS）进展使得以最小测序偏差对数千细胞的拷贝数状态进行刻画成为可能。Direct Library Preparation+（DLP+）是一种无全基因组扩增的scWGS方法，利用修饰Tn5转座酶切割每个细胞基因组并连接测序接头，以＜0.1×覆盖度实现高通量测序。尽管实验方法不断进步，scWGS数据分析仍滞后，现有方法未针对保存质量不一的冷冻样本优化，且主要依赖预设基因组区间（bin）内的读数深度比进行拷贝数calling，导致全基因组加倍（whole genome doubling，WGD）不可识别。为此，研究人员提出Songbird，一种对WGD敏感的单细胞scWGS拷贝数caller，在断点识别和真实拷贝数检测上均优于现有工具。研究人员证明，Songbird在极低覆盖度下具有稳健性，可适配hg19、hg38、hs.1等多种基因组版本，并可扩展至其他依赖Tn5 tagmentation碎裂基因组的scWGS方法。
研究背景方面，拷贝数变异（copy number variation，CNV）广泛存在于多数实体瘤中，常通过癌基因驱动的全基因组加倍（whole genome doubling，WGD）等机制促进非整倍体形成与肿瘤适应度提升。现有单细胞全基因组测序（single-cell whole genome sequencing，scWGS）方法可分为PCR类、等温扩增类和转座酶类；其中DLP+利用Tn5转座酶标签化（tagmentation）实现浅覆盖下的准确拷贝数恢复。然而，依赖binned read count的工具无法区分WGD与正常细胞，因为区域间读数深度比不变；基于SNP定相的工具如CHISEL、Alleloscope需要较高深度，且不能检测完美WGD。scAbsolute与ASCENT虽利用DLP+特性，但仍有局限。因此，研究人员开展本研究，提出Songbird，以在浅覆盖、冷冻样本及Tn5类scWGS数据中实现WGD可识别的绝对拷贝数calling。论文发表于《Nucleic Acids Research》。
主要关键技术方法方面，研究人员使用剑桥大学医院食管腺癌患者手术与内镜样本，以及hTERT淋巴母细胞样细胞系和HEK293T细胞系；通过DLP+构建倍性梯度（ploidy ladder），总基因组含量覆盖2N至10N。数据经mondrian流程比对至GRCh38并去重，生成bedpe片段文件；模拟数据由CINner生成染色体不稳定演化剖面后再模拟片段计数；真实数据还涵盖Laks、PEO1、DnTR-Seq、LIANTI及SmoothSeq PacBio等长读长平台。工具比较对象包括HMMCopy、SCOPE、CHISEL、Alleloscope、scAbsolute、ASCENT；地面真值由ASCAT对假批量样本估计。Songbird本身由非平衡哈尔小波断点识别、片段几何倍性估计、亚克隆与WGD检测、整数拟合四部分构成。
研究结果方面，第一项结果为Tn5-based scDNA-seq libraries contain artifactual reads that bias the frequency of read overlaps。研究人员发现DLP+中存在起始或终止坐标相同但长度不同的同源方向片段对，占重叠片段比例显著，源于PCR前或早期扩增步骤；这些人为片段会扭曲重叠频率，因此Songbird在过滤中剔除每对中的较短片段。
第二项结果为Songbird accurately recalls copy number breakpoints in simulated and real scDNA-seq data。研究人员以CINner模拟细胞及HEK293T真实细胞评估，使用Jaccard Index与Wasserstein Distance比较Songbird非平衡哈尔小波与HaarSeg、CoNVEX、HMMCopy、Circular Binary Segmentation等。结果显示Songbird断点回收优于既有哈尔小波方法，与CBS相当，且在0.01×覆盖下仍稳定，高拷贝多样性样本中表现更好。
第三项结果为Songbird accurately estimates total cell ploidy。研究人员利用唯一片段在参考片段上游与非重叠窗口的密度比估计倍性，理论比值为(n?1)/n。在2N至6N倍性梯度中，Songbird原始倍性中位数准确，且不依赖基因组版本；HMMCopy与SCOPE将多倍hTERT误判为2，Alleloscope与scAbsolute倾向 diploid，仅ASCENT与Songbird可正确识别2× hTERT；高于6N时Songbird趋于低估。
第四项结果为整体工具评估与跨平台扩展性。研究人员在模拟、DLP+真实队列、倍性梯度及PacBio/LIANTI等数据中比较RMSE、Shapiro–Wilk正态性及分位数一致性，证明Songbird在高拷贝事件、ecDNA/BFB类局灶扩增、WGD判定及hg19/hg38/hs.1适配上优于现有工具。
讨论与结论部分，研究人员指出，已有binned-depth工具的根本限制是WGD不可识别；Songbird通过片段几何而非仅深度比，解决了浅覆盖下绝对倍性与WGD敏感性问题。其非平衡哈尔小波提升断点定位，上游/重叠片段密度比回归出细胞质量效应，亚克隆聚类与k=2 K-means辅助WGD标记，似然比最大化完成整数拷贝数拟合。研究结论可译为：Songbird是一种基于哈尔小波、对全基因组加倍敏感的单细胞全基因组拷贝数caller；研究人员显示其在模拟scWGS数据、已有DLP+数据集及实验倍性梯度中，能准确捕获高拷贝数事件并优于现有工具估计倍性；该工具兼容hg19、hg38与hs.1人类基因组版本，并可推广至其他Tn5标签化scWGS方法，为冷冻样本、浅覆盖肿瘤单细胞拷贝数分析提供了更可靠的分析框架。
