鸡胚苗勒管分化的单细胞转录组学新见解

《PLOS Genetics》：New insights into Müllerian duct differentiation provided by single cell transcriptomics in the chicken embryo

在脊椎动物胚胎中，苗勒管（Müllerian ducts）发育为雌性生殖道。本研究利用鸡胚这一独特的导管发育模型，通过单细胞转录组学对苗勒管分化进行了全面分析。数据揭示了苗勒管分化具有比先前认知更为复杂的细胞组成。对早期形成的苗勒管的转录组分析，确定了苗勒管上皮（MDE）和苗勒管间充质（MDM）这两个主要区室的分子标志。MDE表达PAX2、LHX1、WNT7、LGR5、PDGFA/D和CDH1/2。MDM则以WNT4、EMX2、POSTN、OSR1、VIM、DMRT以及EMT标志物ZEB1/2为特征。在雄性中，退化的间充质（MDM）具有独特的分子特征，表达转录因子MSX1、MSX2、RUNX2、GATA5、DLX3和DLX5，以及信号调控因子DKK4和NRG1（神经调节蛋白）。对退化中的雄性间充质进行单细胞转录谱分析，鉴定出与导管退化相关的新基因，包括WNT拮抗剂DKK4。DKK4响应抗苗勒管激素（AMH）的诱导，并在雌性中异位表达时可诱导导管退化。雌性中的导管间充质遵循不同的命运，其分子特征包括SMARCA2/HMGA2/ZEB1/2/TWIST1/2/DMRT2以及FOXE1、OSR2和HGF（肝细胞生长因子）的持续表达。发育中的雌性导管内的细胞簇反映了导管在后期区域化之前的空间预 patterning。与雄性中AMH介导的双侧苗勒管退化相反，雌性鸡胚表现出左侧导管分化和对侧右侧导管退化的不寻常模式。研究发现，雌性右侧导管并非以与雄性相同的方式退化，其在转录上截然不同，并且缺乏退化中的间充质群体，尽管推测其机制与雄性一样由AMH介导。

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研究背景与目的

在脊椎动物胚胎中，一对称为苗勒管（Müllerian ducts）的胚胎管道发育为雌性生殖道。苗勒管最初在雌雄胚胎中均形成，但其命运在性别间差异显著：雄性胚胎中，导管在睾丸分泌的抗苗勒管激素（AMH）作用下退化；雌性哺乳动物中，AMH缺失使得导管分化为输卵管、子宫和阴道上部。人类中，苗勒管发育异常会导致严重的生殖健康问题，如女性中的MRKH综合征和男性中的持续性苗勒管综合征（PMDS）。然而，多数女性生殖道异常的遗传原因尚不明确，而约12%的PMDS病例病因未知，提示存在除AMH外的新基因调控雄性导管退化。此前对苗勒管发育的理解多基于小鼠和鸡胚模型，但对性分化阶段，尤其是导管退化过程的细胞和分子机制了解有限。为此，本研究旨在利用鸡胚这一独特模型（其雌性右侧导管也会退化），通过单细胞转录组学首次全面解析苗勒管性分化的细胞复杂性和基因调控网络。

主要技术方法

研究人员收集了鸡胚发育关键时间点（E6.5未分化期、E8.5雌雄性分化起始期、E11.0雌性左右导管不对称发育期）的苗勒管组织，共5个样本（含至少3个生物学重复）。采用10X Genomics Chromium系统进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），经质量过滤后获得39,431个细胞的转录组数据。通过Seurat进行聚类分析，利用已知标志基因鉴定细胞类型，并结合伪时间轨迹分析（Palantir）推断细胞谱系。此外，还运用了全胚原位杂交（whole-mount in situ hybridization）、免疫荧光染色以及体内电穿孔（in ovo electroporation）和RCASBP病毒载体介导的基因过表达等功能实验。

研究结果

1. 单细胞RNA测序鉴定出苗勒管中多样的雌雄细胞群体

通过对39,431个细胞进行无偏聚类，鉴定出23个转录上不同的细胞簇，其中17个被确认为苗勒管细胞。这些细胞可分为三大区室：苗勒管上皮（MDE，3个簇）、苗勒管间充质（MDM，12个簇）和苗勒管表面上皮（MSE，2个簇），揭示了远超以往认知的细胞复杂性。

2. 转录组分析确定各区室分子标志并揭示独特细胞群体

MDE表达PAX2、LHX1、WNT7A等经典标志物及新发现的LGR5、PDGFA/D等。MDM高表达VIM、POSTN、WNT4、DMRT1等。MSE则强表达角蛋白KRT7/KRT24及BMP7等。研究还发现了一个此前未报道的、位于导管基部紧邻中肾的独特间充质亚群（Cluster 3和10），表达EBF1、FOXC2等。

3. 鸡胚苗勒管在E6.5时尚未分化

通过雌性特异性标志HINTW的表达分析，证实E6.5时雌雄导管细胞混合存在于同一簇中，无性别特异性簇，表明此时导管在转录水平上尚未发生性二态性分化。

4. MSE的发育

MSE由两个转录相似的亚群（Cluster 4和16）组成，后者为增殖群。该区室在后续发育中保持相对同质性，但会表达新的基因如HGF。

5. MDE的发育

E6.5时MDE包含三个亚群。至E8.5，MDE出现明显性二态性：雄性退化MDE富集SIM1、RORB、BMP3等候选退化调控基因；雌性MDE则富集DLX5、MSX2、HGF等。在E11.0雌性导管中，两个MDE亚群（Cluster 8和15）沿前后轴呈现区域化基因表达，如GFRA1在前部表达，MSX1/2局限于后部，预示导管后期的形态区域化。

6. MDM的发育

E6.5时MDM包含一个未分化间充质群（Cluster 17）和一个持久存在的独特群（Cluster 3/10）。至E8.5，MDM出现显著性二态性：

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  雌性MDM：扩增为6个亚群，其中Cluster 1高度表达EMT相关基因（ZEB1/2、TWIST1/2）、促存活因子（SMARCA2、HGF）和转录因子（FOXE1、DMRT2），代表发育中的间充质。Cluster 6为增殖群。
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  雄性MDM：出现三个独特的退化相关簇（Cluster 7、9、18），表达MSX1、MSX2、RUNX2、DKK4、NRG1等新候选退化基因。空间验证显示，MSX1和DKK4定位于内层间充质（紧贴MDE），而LVRN标记外层间充质。伪时间分析揭示，外层MSX1-/LVRN+群（Cluster 7）是过渡状态，向内层MSX1+/DKK4+群（Cluster 9）转变，后者更接近退化终末状态。
  至E11.0，雌性左侧MDM进一步多样化，出现沿前后轴和径向轴区域化的亚群：内层间充质前部为CPXM2+/PLK2+群，后部为CPXM2-/PLK2+群；外层间充质后部高表达SRD5A2。值得注意的是，尽管右侧雌性导管也在退化，但未检测到类似雄性的独特退化间充质群体或特异性转录本，仅观察到增殖指数降低和前部HOX基因表达改变，提示雌性右侧导管退化机制与雄性根本不同。

7. DKK4的功能分析揭示其在苗勒管退化中的作用

DKK4（一种WNT通路抑制剂）在雄性退化间充质中特异高表达。功能实验表明：（1）在雌性胚胎中过表达AMH可异位激活DKK4表达并诱导导管退化；（2）在雌性左侧导管中单独异位表达DKK4即可诱导显著的导管退化（呈雄性特征的尾-头方向），并导致间充质面积显著减少。这证明DKK4是AMH下游的一个效应因子，通过抑制WNT/β-catenin信号参与调控雄性苗勒管退化。

讨论与结论

本研究通过单细胞转录组学首次全面描绘了鸡胚苗勒管性分化的细胞图谱，揭示了远超预期的细胞异质性。主要结论包括：（1）E6.5时雌雄导管在转录上尚未分化；（2）定义了MSE、MDE和MDM各区室的详细分子标志；（3）发现雌性MDM在E8.5后进入发育程序，而雄性MDM则分化出两种空间和转录上不同的退化间充质群体，并通过伪时间分析重建了其从外层到内层的退化轨迹；（4）鉴定并功能验证了DKK4作为AMH下游的关键效应因子，通过抑制WNT信号促进导管退化；（5）发现雌性右侧导管退化与雄性双侧退化在细胞和分子机制上存在本质差异，前者缺乏特定的退化间充质群体，可能涉及不同的通路（如HOX基因失调）。这些发现不仅加深了对苗勒管生物学基本过程的理解，也为阐明人类苗勒管发育异常（如MRKH和PMDS）的遗传病因提供了重要的候选基因和分子框架。