共发酵小麦胚球蛋白的结构、蛋白质组学及潜在双重功能肽的计算机模拟预测

《Food Bioscience》：Structure, Proteomics, and In Silico Prediction of Potential Dual-Functional Peptides from Co-fermented Wheat Germ Globulin

　　

# 面包酵母和植物乳杆菌序贯共发酵对小麦胚球蛋白结构与功能的调控研究

## 摘要

小麦胚球蛋白具有优异的营养价值，但由于其致密的空间构象和生物活性功能表达有限，其应用受到很大限制。为解决这一问题，本研究探讨了面包酵母和植物乳杆菌序贯共发酵制备的发酵小麦胚球蛋白（FWEG）的结构修饰、抗氧化增强及潜在分子机制。结构表征表明，发酵将未发酵球蛋白的致密构象转变为高孔隙率的微观结构，并伴随显著的二级结构转变（无规卷曲增加9.3%）和大量游离支链氨基酸及芳香族氨基酸的释放。因此，FWEG表现出优异的体外自由基清除能力。无标记液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学分析鉴定出370种差异表达的麦类蛋白（32种上调，338种下调），揭示了天然结构蛋白和代谢枢纽蛋白的广泛降解。与此同时，微生物蛋白质组显示核糖体途径和碳代谢途径高度活跃，反映了其旺盛的代谢状态驱动的胞外蛋白水解。为桥接宏观性质与分子机制，通过计算模拟体内蛋白水解预测了代表性的FWEG衍生短肽（Val-Ser-Val-Phe，VSVF；及Val-Ile-Leu，VIL）。生物信息学评估确认了其非毒性和高肠道生物利用度。分子对接表明，两亲性VSVF肽通过强氢键网络牢固锚定在Kelch-like ECH相关蛋白1（Keap1）的Kelch结构域中（结合能：-8.8 kcal/mol），为抗氧化能力的增强提供了理论分子基础。同时，疏水性VIL肽通过广泛的疏水作用有效占据了Toll样受体4（TLR4）的脂质结合口袋（-6.2 kcal/mol），显示出潜在的抗炎特性的计算线索。总之，微生物共发酵深刻重塑了小麦胚球蛋白的空间结构和蛋白质组特征，释放出具有生物活性的候选肽，有望用于功能性食品开发，值得进一步通过实证肽组学进行验证。

## 引言

小麦胚是小麦加工行业的主要副产品，是优质植物蛋白的丰富来源，约占其干重的30%。小麦胚和小麦胚蛋白因其营养价值、抗氧化潜力、降血脂功效以及在功能性食品和生物活性肽开发中的适用性而受到越来越多的关注（Karami等，2019；Liu等，2022；Pan等，2025）。球蛋白是小麦胚的主要功能性蛋白组分之一，具有优异的营养特征。然而，天然小麦胚球蛋白（WGG）通常以致密的、高度折叠的空间构象存在，受广泛的分子内和分子间相互作用的强力稳定。这种致密的结构网络将功能性氨基酸残基和生物活性肽序列紧密掩埋在蛋白质核心中，从而限制了其溶解性、胃肠生物可及性以及抗氧化能力等生理功能。先前的研究表明，小麦胚蛋白可以通过水解或发酵转化为具有抗氧化、ACE抑制等健康相关活性的生物活性肽，表明破坏小麦胚蛋白的结构是改善其功能特性的有效策略（Bayat等，2022；Karami等，2019；Y. Liu等，2024）。

微生物发酵，特别是利用乳酸菌和酵母，已被广泛认可为一种可持续且高效的生物工具，用于修饰膳食蛋白。在发酵过程中，微生物分泌的复杂酶系统，包括蛋白酶和肽酶，协同作用将大分子蛋白水解为低分子量肽和游离氨基酸。乳酸菌和酵母已被广泛应用于谷物和植物基底物中，以改善营养质量、抗氧化能力、风味和生物可及性（Bayat等，2022；Ghamry等，2023；S. Kim等，2022）。近期的研究报告指出，发酵小麦胚提取物表现出改善的感官特性、升高的功能性因子含量和增强的健康促进作用，包括抗氧化和免疫调节活性（Bayat等，2022；Khosroshahi等，2022；W. Liu, Liu等，2024；Pan等，2025；Wu等，2020）。特别值得注意的是，小麦胚与酿酒酵母和植物乳杆菌的发酵已被证明能够增强成分组成和体外抗氧化特性，而混合发酵则被报道比单菌株发酵更有效地改善小麦胚的稳定性和抗氧化活性（Bayat等，2022；Khosroshahi等，2022）。尽管这些研究强调了发酵的宏观优势，但专门针对提取的"球蛋白"组分、关注其构象展开和功能增强的全面研究仍然稀缺。

更重要的是，传统的物理化学表征仅反映了发酵的宏观结果。蛋白质组成在分子层面的深刻改变——从根本上决定了球蛋白组分的结构和功能变化——尚未被充分阐明。无标记液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学是一种强大的分析技术，能够在不进行同位素标记的情况下深入分析复杂的蛋白质混合物并识别蛋白质水平的变化（He等，2019）。在食品和肽研究中，LC-MS/MS也被广泛用于肽鉴定、定量分析和发酵衍生肽化合物的表征（Guan等，2019；H. J. Kim等，2021）。通过鉴定差异表达蛋白（DEPs）并将其映射到代谢网络中，蛋白质组学分析可以同时阐明发酵过程中底物的降解命运和微生物的代谢响应。这种分子水平的信息对于将发酵诱导的蛋白水解与生物活性肽的生成和功能特性联系起来至关重要。

除了实验蛋白质组学，计算模拟策略在筛选和机制解读食品衍生的生物活性肽方面变得越来越重要。分子对接和分子动力学模拟已被用于研究食品衍生的抗氧化肽与Keap1-Nrf2（Kelch-like ECH相关蛋白1/核因子红细胞2相关因子2）途径之间的相互作用，该途径在细胞抗氧化防御中起着核心作用（Gao等，2024；W. Liu, Liu等，2024；Tonolo等，2020；Wu等，2024）。同样，分子对接也被应用于鉴定和表征来自食品蛋白的抗氧化和抗炎肽，包括来自食用燕窝、核桃粉水解物、鱼蛋白和其他膳食来源的肽（Guha & Majumder，2019；Lee等，2024；Prakash Nirmal等，2023；Xu等，2023）。这些研究表明，基于对接的分析可以提供机制线索，帮助理解短肽如何与氧化应激或炎症相关靶点相互作用，尽管这些计算预测应谨慎解读并进一步实验验证。

因此，本研究旨在探讨脱脂小麦胚中提取的球蛋白在精确控制的序贯共培养（面包酵母和植物乳杆菌）后的功能增强。我们系统地评估了其氨基酸组成、微观形态、二级结构和体外抗氧化活性的变化。同时，采用双视角无标记LC-MS/MS蛋白质组学方法，深入分析底物降解（小麦蛋白质组）和微生物代谢响应。由于发酵主要目的是在结构上松动复杂的蛋白质基质，我们随后对深度降解的代表性蛋白进行计算模拟体内胃肠蛋白水解（使用人胃蛋白酶和胰蛋白酶），以预测人类食用时最终释放的生物利用肽。经过生物信息学安全性预测后，进行分子对接以可视化这些代表性的胃肠释放肽如何靶向关键的细胞氧化（Keap1）和炎症（TLR4）受体。通过桥接宏观物理化学性质与微观蛋白质组和计算数据，本工作提供了对发酵小麦胚球蛋白结构-功能关系的全面理解。

## 材料与方法

### 材料和试剂

脱脂小麦胚粉购自河南坤华生物科技有限公司（中国河南）。植物乳杆菌M618由本实验室提供。面包酵母购自安琪酵母股份有限公司（中国湖北）。DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。用于蛋白质组学消化的测序级胰蛋白酶购自Promega（美国）。其他分析级化学品和

## 发酵引起的结构和形态学修饰

发酵前后小麦胚球蛋白的微观形貌通过扫描电子显微镜（SEM）进行了可视化观察（图1A和1B）。未发酵样品（WGG）呈现出致密的、紧凑的、相对光滑的片状结构，反映了由强健的分子间力稳定的完整且高度聚集的蛋白质基质。相反，发酵样品（FWEG）呈现出明显粗糙的、松散的、高孔隙率的微观结构，其特点是存在众多内部空腔。

## 讨论

FWEG的物理化学和功能改善可以解释为发酵诱导的结构松弛、蛋白水解降解和肽水平功能重塑的综合结果。SEM观察显示，天然小麦胚球蛋白（WGG）的紧凑片状形态在序贯共发酵后转变为更松散和孔隙率更高的框架结构。这种结构破坏与小麦蛋白质组数据一致，其中338种天然...

## 结论

本研究系统地阐明了在脱脂小麦胚与面包酵母和植物乳杆菌序贯共发酵后提取的小麦胚球蛋白（WGG）的结构、功能和分子修饰。微生物发酵过程有效地展开了天然球蛋白的致密空间构象，将其转变为具有显著二级结构转变的高孔隙率微观结构，特别是无规卷曲增加了9.3%...

## CRediT作者贡献声明

丁琳琳：撰写——初稿，软件，方法论，数据管理，概念构思。
黄继红：撰写——审阅与编辑，验证，监督，软件，资源，项目管理，方法论。
余光海：撰写——审阅与编辑，可视化，验证，监督，软件，资源，项目管理，方法论，调查，资金支持获取，形式分析，数据管理，概念构思。
潘龙：撰写——审阅与编辑，撰写——...

## 未引用参考文献

Liu等，2024；Liu等，2024；UniProt Consortium，2023。

## 数据可用性

在当前研究和/或分析过程中产生的原始LC-MS/MS肽组数据集可向通讯作者合理索取。

## 声明

作者声明不存在利益冲突。

## 资金支持

本研究由河南理工大学脱新团队培育项目（编号：2025TXTD14）、河南理工大学青年骨干教师培养计划、河南理工大学高层次人才研究基金（编号：2020BS064）支持。

## 利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究中报告工作的已知的竞争性财务利益或个人关系。

潘龙 | 丁琳琳 | 袁永健 | 蔡景阳 | 山野波 | 廖爱梅 | 侯引辰 | 刘全平 | 黄继红 | 余光海