多酚介导的肌原纤维蛋白稳定化：石榴皮提取物对冻融稳定性和凝胶化的影响

《Food Chemistry》：Polyphenol-mediated stabilization of myofibrillar proteins: Effects of pomegranate peel extract on freeze-thaw stability and gelation

　　- PPE减轻冻融循环（FT）诱导的氧化作用，保持肌原纤维结构。- PPE与蛋白质之间的相互作用抑制蛋白质聚集和展开。- PPE稳定肌原纤维蛋白的二级和三级结构。- PPE抑制冻融循环过程中冰晶的生长和重结晶。- PPE增强凝胶网络，提高强度和质构特性。**引言**近年来，鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）因其资源广泛、成本低廉、富含优质肌原纤维蛋白（MP）、脂肪含量低以及具有优异的凝胶形成能力和理想的白度和质构，已成为鱼糜生产的一种有前景的替代原料（Wang, Sun, et al., 2026; Zhang et al., 2026）。鱼糜是一种浓缩的肌原纤维蛋白基质，凭借其独特的凝胶化行为、粘弹性和中性风味，被广泛用于开发海鲜模拟食品。然而，其高水分和高蛋白的组成使其在加工和储存过程中极易发生氧化、变性和聚集（Ma et al., 2025; Zhang et al., 2026）。冷冻被广泛用于延长鱼糜的保质期并维持其功能品质；然而，加工、运输和储存过程中的温度波动往往导致反复的冻融循环（Wang, Chen, et al., 2026; Xu et al., 2026）。如图S1所示，冻融循环的机制如下：冰晶的形成和重结晶产生机械应力，同时伴随脱水和溶质浓缩（A）；由此导致的氢键失稳、疏水区暴露和巯基氧化，破坏了肌原纤维蛋白的完整性，最终导致蛋白质变性和凝胶网络减弱（B）；与此同时，离子强度增加和活性氧物种的产生促进了蛋白质氧化、聚集、交联和品质劣化（C）。这些变化表现为Ca²⁺-ATPase活性和巯基含量降低，羰基水平升高，表面疏水性增加，以及构象转变——尤其是α-螺旋向β-折叠结构的转变，从而损害凝胶强度、弹性和持水性，降低产品整体品质（Liang et al., 2026; Walayat et al., 2024; Xu et al., 2026）。为减轻冷冻诱导的品质劣化，商业冷冻保护剂通常为蔗糖和山梨糖醇的组合（各4%），被广泛用于稳定鱼糜蛋白（Wang, Chen, et al., 2026; Xu et al., 2026）。然而，其应用存在诸多缺点，包括冷冻保护效率有限、甜度过高、热量增加以及对产品质构和营养组成产生不良改变（Jiang et al., 2025; Ma et al., 2025; Zhang et al., 2025）。此外，消费者对清洁标签、低糖和以健康为导向的食品日益增长的偏好，引发了人们对继续使用此类添加剂的担忧。这些局限性促使开发了富含酚类的果副产品提取物作为天然冷冻保护剂，因为其能够在分子水平上稳定肌原纤维蛋白并保持其功能（Sharma, Majumdar, Mehta, Ngasotter, & Gaurav, 2024; Yan et al., 2026）。与传统冷冻保护剂主要通过优先水化、增加冻浓未冻相的粘度（玻璃化）以及抑制冰晶重结晶来间接减少冷冻诱导的蛋白质变性不同（Wang, Chen, et al., 2026; Xu et al., 2026），提取物的多酚通过共价相互作用（醌介导的与亲核氨基酸残基的反应）和非共价相互作用（包括氢键、疏水相互作用和π-π堆积）直接与肌原纤维蛋白发生相互作用，从而提供多功能保护。这些分子相互作用增强了蛋白质水化壳层，限制了构象运动性，并通过维持分子内氢键和限制疏水区的暴露来保持蛋白质天然的二级和三级结构。因此，冷冻胁迫期间的蛋白质展开、巯基氧化、分子间交联和不可逆聚集均受到抑制。同时，多酚中丰富的羟基（-OH）与水分子相互作用，限制冰晶的生长和重结晶，并最大限度减少冻浓效应。蛋白质基质和水相的协同稳定作用保持了蛋白质的溶解性、持水性和三维凝胶网络的完整性，从而在冷冻储存过程中增强凝胶强度、质构和整体功能稳定性（Li et al., 2025; Sharma et al., 2023; Xiang et al., 2026; Zhou et al., 2025; Zhu et al., 2025）。在众多多酚天然来源中，石榴皮是一种未被充分利用的工农业副产品，富含鞣花单宁、酚酸和类黄酮，其抗氧化潜力高于许多常见的植物提取物（Azmat et al., 2024; Cai et al., 2021; Joseph et al., 2024; Patra et al., 2022; Singh et al., 2018）。其化学多样的多酚谱和大量的-OH基团为与肌原纤维蛋白的直接相互作用提供了更大的潜力。与此一致的是，我们此前的研究系统地评估了六种石榴皮提取物浓度（0.15–0.90%，w/w），确定0.45%为增强鲢鱼鱼糜功能性、凝胶品质和微结构完整性的最佳浓度，而更高浓度则会逐步降低功能特性和白度（Sharma et al., 2022）。此外，以往关于植物多酚的研究主要集中于改善鱼糜的凝胶化和冷冻储存稳定性（Dang et al., 2025; Sharma, Majumdar, Mehta, Ngasotter, & Gaurav, 2024; Sharma, Majumdar, Mehta, Panda, & Ngasotter, 2024; Xiang et al., 2026; Xiao et al., 2024; Zhou et al., 2025），而其在反复冻融循环过程中蛋白质氧化、聚集、二级和三级结构稳定性以及肌原纤维蛋白功能性之间的分子机制仍知之甚少。据我们所知，尚无系统性研究在反复冻融条件下比较植物多酚提取物与传统冷冻保护剂的冷冻保护行为，同时阐明肌原纤维蛋白稳定的分子机制。因此，我们假设富含多酚的石榴皮提取物直接与肌原纤维蛋白（尤其是肌球蛋白）相互作用，从而稳定蛋白质构象，减少氧化修饰和聚集，保持水化基质，并抑制反复冻融循环中的冰晶重结晶。据此，本研究系统地评估了先前优化的石榴皮提取物浓度（0.45%，w/w）与传统冷冻保护剂在反复冻融条件下的冷冻保护效果。通过整合蛋白质氧化、聚集、结构转变、冰晶形态、凝胶化和微结构分析，本研究旨在建立反复冻融循环过程中分子稳定与功能保持之间的机制联系，并评估石榴皮提取物作为天然冷冻保护剂的潜力。**各部分摘要****材料**石榴（Punica granatum）皮从附近市场周围的果汁中心收集。鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）以死亡状态从当地商业鱼类市场采购，并以冷藏条件通过保温冰箱运送至实验室用于鱼糜制备。本研究中使用的所有化学品和试剂均为分析纯。**石榴皮提取物（PPE）的制备**PPE的制备按照我们此前的方法（Sharma et al., 2022）进行。简言之，石榴皮经清洗后，**PPE对冰晶形态的影响**评估冰晶形态和大小分布，以阐明PPE对冻融循环诱导的鱼糜结构劣化的影响（图1）。在冻融0次时，所有处理组均表现出较小且分布均匀的冰晶；然而，对照组和阳性对照组的平均晶体大小相当（分别为11.15和11.11 μm），而PPE处理组产生了显著更细的晶体，平均大小较低（8.24 μm）。相应的粒径分布直方图进一步**结论**PPE通过抑制蛋白质氧化、稳定肌原纤维蛋白结构以及保持反复冻融循环过程中的凝胶形成功能，发挥了多方面的冷冻保护作用。与传统冷冻保护剂主要通过优先水化机制发挥作用不同，PPE通过直接调控蛋白质构象、限制聚集和氧化交联以及维持凝胶网络的结构和功能完整性，提供了多功能保护。**生成式AI使用声明**在准备本工作的过程中，作者使用了ChatGPT（Go版本）以提高英语的清晰度、语法和整体流畅性。使用该工具后，作者审核并编辑了内容，对发表文章的內容承担全部责任。**CRediT作者贡献声明****Sanjeev Sharma：** 撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、方法论、调查、形式分析、概念化。 **Nitish Bansal：** 撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、验证、资源、调查。 **Dalip Kumar Bishnoi：** 撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、验证、监督、资源、调查。 **Pallavi Bhalavey：** 撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、调查。 **Krishan Kumar Yadav****伦理声明**本研究中未对任何活体动物进行实验操作，因此无需动物伦理审批。**资金支持声明**本研究未获得公共、商业或非营利部门基金机构的任何专项资助。**利益冲突声明**作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。**致谢**作者衷心感谢哈里亚纳查兰辛格农业大学渔业科学学院院长（印度哈里亚纳邦希萨尔）提供的支持和指导，其提供的实验室设施和良好的研究环境对本研究的顺利完成作出了重大贡献。Sanjeev Sharma | Nitish Bansal | Dalip Kumar Bishnoi | Pallavi Bhalavey | Krishan Kumar Yadav | Soibam Ngasotter | Rishi Pal Yadav | Khushbu Gurawa | Nirmal Patel | Deeksha Hooda | Ritika A. Tandel